p31实验四实验四 分光光度技术与分光光度技术与 葡萄糖氧化酶法测定血糖葡萄糖氧化酶法测定血糖一、分光光度法一、分光光度法 分光光度法是根据不同物质对于不同分光光度法是根据不同物质对于不同波长的光波具有选择性吸收的光学特性，波长的光波具有选择性吸收的光学特性，建立起来的分析方法。建立起来的分析方法。（一）分光光度法的依据（一）分光光度法的依据I0It溶液溶液 当一定波长的光线通过某种当一定波长的光线通过某种透明介质透明介质时，时，其中一部分光可透过，一部分光被吸收，这种其中一部分光可透过，一部分光被吸收，这种某种溶液对一定波长的光的某种溶液对一定波长的光的吸收特性吸收特性可用于该可用于该物质的物质的定性和定量分析定性和定量分析。分光光度计可获得分光光度计可获得单色光单色光 分光光度计利用棱镜或光栅取得波长范围分光光度计利用棱镜或光栅取得波长范围为几个为几个nm甚至更窄的单色光。甚至更窄的单色光。测定的时候需选择不同物质测定的时候需选择不同物质最大吸收峰所对应的波长最大吸收峰所对应的波长波长波长（nm ）光光吸吸收收值值最大吸收峰最大吸收峰分光光度计的优点分光光度计的优点 分光光度法的灵敏度、准确度及选择性分光光度法的灵敏度、准确度及选择性都很高，是一种最常用的灵敏、精确、都很高，是一种最常用的灵敏、精确、快速和简便的分析方法。快速和简便的分析方法。不同分光光度计的波长范围不同分光光度计的波长范围紫外光紫外光(200-400nm)可见光可见光(400-760nm)红外光红外光(760nm-30m)（二）分光光度法原理（二）分光光度法原理 Lambert-beer定律，该定律阐明了溶液定律，该定律阐明了溶液对单色光吸收的多少与溶液浓度及液层厚度对单色光吸收的多少与溶液浓度及液层厚度的乘积成正比关系。的乘积成正比关系。I0Itlg=KCLI0Itlg：光密度（光密度（O.D.），或称吸光度（），或称吸光度（A）I0：入射光强度入射光强度It：透过光强度：透过光强度K：吸光系数，它与该物质吸收光能力有关：吸光系数，它与该物质吸收光能力有关I0Itlg=KCLC：溶液浓度：溶液浓度(mol/L)L：液层厚度：液层厚度(cm)（三）分光光度法计算待测溶液浓度的方法（三）分光光度法计算待测溶液浓度的方法1 1、利用标准溶液测定溶液的浓度、利用标准溶液测定溶液的浓度A标标= KC标标LA样样= KC样样LA标标A样样C标标C样样2 2、利用标准曲线求得待测溶液的浓度、利用标准曲线求得待测溶液的浓度标准曲线的制作：标准曲线的制作： 先配制一系列已知不同浓度的测定物标准先配制一系列已知不同浓度的测定物标准溶液，按测定管显色，分别读取各管光密度，溶液，按测定管显色，分别读取各管光密度，以各管光密度为纵坐标，各管浓度为横坐标，以各管光密度为纵坐标，各管浓度为横坐标，作图得标准曲线。作图得标准曲线。浓度浓度吸吸光光度度以测定管的光密度从标准以测定管的光密度从标准曲线上可求得测定物浓度曲线上可求得测定物浓度（四）分光光度计的基本结构（四）分光光度计的基本结构1 1、光源、光源2 2、单色光器、单色光器3 3、吸收杯（比色杯）、吸收杯（比色杯）4 4、检流计（测光系统）、检流计（测光系统）752型分光光度计n1）A/T/C/F切换键n2）SD键具2个功能。传输数据；确认当前的F值。n3）/0%调T为000.0。n4)/100%调T为100.0。转换至A时，按键后显示0.000。（五）操作规程（五）操作规程n1.插上电源，打开电源开关预热30min。n2.将波长旋钮旋至所需波长。n3.将样品倒入比色皿放入比色皿架，空白管进入光路，按A/T/C/F键至光标于T位，开盖按/0%键使读数显示000.0。关盖，再按/100%键使读数显示100.0。按A/T/C/F键至光标于A位，再按/100%显示0.000。拉出样品管进入光路读A。n4.测定结束打开样品室盖。n5.取出比色皿清洗干净后用蒸馏水冲洗并倒扣在粗滤纸上晾干。实验目的实验目的n了解葡萄糖氧化酶法测定血糖的基本原理。n掌握酶法测定血糖的实验方法n熟悉分光光度计的使用。 P57二、葡萄糖氧化酶法测定血糖二、葡萄糖氧化酶法测定血糖n实验原理：实验原理：葡萄糖葡萄糖O2+H2O GOD 葡萄糖酸内酯葡萄糖酸内酯2O222O2 + 4-氨基安替比林氨基安替比林+酚酚 POD 红色醌类化合物红色醌类化合物 + 2O +O2 用分光光度法将待测溶液与同样处理的葡用分光光度法将待测溶液与同样处理的葡萄糖标准液比色，求待测血糖浓度。萄糖标准液比色，求待测血糖浓度。仪器和药品：仪器和药品：n血清、血糖试剂盒n752可见紫外分光光度计。基本操作基本操作n取三支试管，编号，下表加样计算血糖浓度编号试剂ml空白管标准管测定管血清0.02葡萄糖标准液(100mg/dl)0.02酚试剂1.51.51.5酶试剂1,51.51.5混匀后37度保温15分钟,在505nm波长处比色，显色后2小时稳定。吸量管的使用n拿吸量管正确姿势n取液姿势n卸放姿势微量取样器的操作n调至所需体积值；吸：垂直持取样器用大拇指按至第一档第一档；将吸头插入溶液松开大拇指，液面上升；放：移出液面，按至第一档继续按至第二档继续按至第二档以排空液体。n注意：移取另一样品时，更换新吸头。计算公式计算公式测定管吸光度值标准管吸光度值葡萄糖含量(mg/dL)=100参考数据： A测=0.217，A标=0.258， 葡萄糖含量=84mg/dl 思考题思考题n试分析影响本试验的因素有哪些？n操作分光光度计时要注意哪些关键点？