全内反射荧光显微镜发展历史优势应用分型及结构基本原理基本原理发展与展望发展与展望细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。和定量研究的工具之一。和定量研究的工具之一。和定量研究的工具之一。 发展历史荧光显微镜的概念荧光显微镜的概念 在细胞生物学方面，传统光学显微镜始终不能解决生物在细胞生物学方面，传统光学显微镜始终不能解决生物样本显微中的几个重要问题：样本显微中的几个重要问题： 1.1.显微图像的显微图像的信噪比信噪比不高；不高； 2.2.光源对生物样本照射的损伤；光源对生物样本照射的损伤； 3.3.光学衍射所致的光学衍射所致的分辨极限分辨极限（R 0. 61/nsinR 0. 61/nsin）：）： 传统的光学显微镜由于受到传统的光学显微镜由于受到光瞳远场衍光瞳远场衍射效应射效应的影响的影响, ,存在分辨极限存在分辨极限, ,瑞利将之归纳为瑞利将之归纳为R 0. R 0. 61/nsin(u/2)61/nsin(u/2) , ,其中其中R为分辨力为分辨力,为成像光波波长为成像光波波长, nsin(u/2), nsin(u/2)为为物透镜的物透镜的数值孔径数值孔径, ,即即NA NA 值，值，u为孔径角为孔径角,因此光学显微镜空间分辨因此光学显微镜空间分辨极限极限250 nm250 nm。发展历史全内反射荧光显微术的发展历程全内反射荧光显微术的发展历程近年来人近年来人近年来人近年来人们们开开开开发发出了一系列光学出了一系列光学出了一系列光学出了一系列光学显显微微微微镜镜。其中，其中，其中，其中，全内反射全内反射全内反射全内反射荧荧光光光光显显微微微微术术(Total internal (Total internal (Total internal (Total internal reflection fluorescence microscopy ,reflection fluorescence microscopy ,reflection fluorescence microscopy ,reflection fluorescence microscopy ,TIRFMTIRFMTIRFMTIRFM) ) ) )是近年来新是近年来新是近年来新是近年来新兴兴的一种光学成像技的一种光学成像技的一种光学成像技的一种光学成像技术术。全内反射荧光显微术的发展历程全内反射荧光显微术的发展历程Hirsch fieldHirsch field完成了完成了第一个第一个全内反射全内反射荧光光实验19651965年年AxelrodAxelrod等生物物理等生物物理学家学家对TRIFMTRIFM技技术及基本原理及基本原理进行描行描述，并探索了其生述，并探索了其生物物应用。用。 20世世纪纪80808080年代早期年代早期年代早期年代早期20世世纪纪9090年代年代新型物新型物镜透透镜、聚光、聚光镜和超灵敏探和超灵敏探测器的器的出出现，使，使TRIFMTRIFM技技术得到充分得到充分发展。展。19951995年年YanagidaYanagida小小组用用TIRFMTIRFM技技术首次在液体溶首次在液体溶液中得到了液中得到了荧光光标记的的单个个蛋白蛋白质分子的分子的成像。成像。该项技技术已已经应用到用到许多多单分子的研究中分子的研究中这这是首次是首次是首次是首次尝试尝试用全内反射用全内反射用全内反射用全内反射荧荧光光光光法法法法测测液体中的液体中的液体中的液体中的单单个分子的个分子的个分子的个分子的荧荧光。光。光。光。将全反射理将全反射理将全反射理将全反射理论论与生物与生物与生物与生物细细胞的胞的胞的胞的荧荧光成像技光成像技光成像技光成像技术术相相相相结结合是一种全新合是一种全新合是一种全新合是一种全新的突破。的突破。的突破。的突破。 肌球蛋白肌球蛋白肌球蛋白肌球蛋白酶酶活性活性活性活性测测量，肌收量，肌收量，肌收量，肌收缩缩力的力的力的力的产产生，生，生，生，荧荧光光光光标记驱动标记驱动蛋白蛋白蛋白蛋白动态动态研究。研究。研究。研究。19961996年年MoernerMoerner小小组又用又用这项技技术实现了限制在了限制在丙丙烯酰胺胶体胺胶体的的纳米孔中的米孔中的单分子的三分子的三维成像。成像。至今至今基本原理基本原理全内反射全内反射荧光光显微微镜的基本的基本设计思路思路全内反射全内反射荧光光显微微镜的基本原理的基本原理全内反射全内反射荧光光显微微术是利用全内反射是利用全内反射产生的消逝波生的消逝波激激发样品品, ,从而使从而使样品表面数百品表面数百纳米厚的薄米厚的薄层内的内的荧光光团受到激受到激发, ,荧光成像的信噪比大大提高。可以看到光成像的信噪比大大提高。可以看到样品表品表面，面，单分子的活分子的活动情况。情况。这种方法的成像装置种方法的成像装置简单，极易，极易和其它成像技和其它成像技术、探、探测技技术相相结合，目前已成功的合，目前已成功的实现100nm100nm甚至更低的空甚至更低的空间分辨率。分辨率。基本原理基本原理全内反射全内反射荧光光显微微镜的基本的基本设计思路思路全内反射全内反射荧光光显微微镜的基本原理的基本原理荧光激光激发原理原理荧光光捕捕捉捉原原理理snellsnell定律定律: :n1sin1=n2sin2当n1大于n2时，全反射就可能发生:2=90c=sin-1(n2/n1)即所有的入射光线全部反射出来,称为全内反射荧光激光激发原理原理沿着入射面上的介质边界传播在平行界面方向以平行波场方式传播在垂直界面方向则是呈指数衰减。隐失波的强度-深度图荧光激光激发原理原理非均匀波透射透射透射透射强强度和浸透深度公式度和浸透深度公式度和浸透深度公式度和浸透深度公式T12（i）- 分界面分界面处的透射的透射强度度d 12 - 渗透深度渗透深度i - 入射角入射角 - 入射光波入射光波长对于可见光波长380780nm而言，浸透深度为100nm。荧光激光激发原理原理箭头箭头表示激光的方向，激光被全反射，同时产生在z方向成指数衰减的隐失波。黄色小圆点黄色小圆点表示被隐失波激发的荧光分子，白色小圆点白色小圆点表示未被激发的荧光分子。荧光光捕捕捉捉原原理理CCD相机CCD相机的高灵敏度高灵敏度高灵敏度高灵敏度特点使全内反射荧光显微镜利用消逝波照射样品并使其成像成为可能，也成就了其高信噪比。 CCD相机的快速成像快速成像快速成像快速成像特点提高了其时间分辨率，使得观察单分子的运动、细胞物质的分泌、蛋白质的相互作用成为可能并成为这方面的优势观察仪器。 目前使用CCD 探测,可达到的量子产率已到80 % ,成像速率200 Hz.当对活细胞成像时,为了达到单分子级的灵敏度或是为了减少曝光时间,需要采用图像增强器。荧光光捕捕捉捉原原理理全内反射显微镜的分型及其结构全内反射荧光显微镜根据其成像系统的不同可分为棱镜型和物镜型两种类型两种类型的全内反射荧光显微镜成像系统，1）为棱镜型，2）为物镜型。 （一）棱镜型全内反射荧光显微镜利用激光经过棱镜并产生全内反射，其消逝波照射已被荧光标记的生物样品，其激发光从另一侧进入物镜并被CCD相机捕捉。棱镜型全内反射荧光显微镜光路示意图棱镜型全内反射荧光显微镜光路示意图评价棱镜型系统在实现上更加容易，它只需要激光光源、棱镜和显微镜。在探测上，它也不容易受到入射光信号的干扰。放置样品的空间受到棱镜的限制。（二）物镜型全内反射显微镜 收集样品荧光信号的接收器 显微镜的物镜 发生全内反射的光学器件。由于细胞的典型折射率为1. 331. 38 ,因此要想实现全内反射,物镜的NA 必须大于1. 38 。表达式为：NA = nsin（u/2） nsin（u/2） nsincNA 为物镜的数值孔径, n ,u分别为物镜的折射率(浸没油) 和孔径角。c 为发生全反射的临界角。二者比较棱镜型全内反射荧光显微镜物镜型全内反射荧光显微镜05级医学实验级医学实验宋一萌宋一萌90513111全内反射荧光显微技术利用全内反射产生全内反射荧光显微技术利用全内反射产生的消逝波激发样品，由于消逝波强度成指的消逝波激发样品，由于消逝波强度成指数衰减，使激发区域限定在样品表面的一数衰减，使激发区域限定在样品表面的一薄层范围内，因此具有其它光学成像技术薄层范围内，因此具有其它光学成像技术无法比拟的高信噪比。无法比拟的高信噪比。当今世界上研究单分子科学最具前途的新当今世界上研究单分子科学最具前途的新型生物光学显微技术之一型生物光学显微技术之一可用来实现对单个荧光分子的直接探测。可用来实现对单个荧光分子的直接探测。全内反射荧光显微镜里用消逝波作为样品的激发光源，并用有着高灵敏度和高时间分辨率的CCD相机(成像速率200Hz)捕捉样品荧光，因此具有如下优点：1：信噪比高（相对共聚焦显微镜）：信噪比高（相对共聚焦显微镜） 2：分辨率高（相对其他的光学显微镜）：分辨率高（相对其他的光学显微镜） 3：对生物样本损伤小（相对电镜）可：对生物样本损伤小（相对电镜）可以进行活体物质的研究和单分子的动以进行活体物质的研究和单分子的动态研究。态研究。全内反射荧光显微术正是凭借其独特的优全内反射荧光显微术正是凭借其独特的优势势(它的荧光激发深度只在它的荧光激发深度只在100 nm 的薄的薄层范围内层范围内),从而成为研究从而成为研究细胞表面科学细胞表面科学如生如生物化学动力学、单分子动力学的最有前途物化学动力学、单分子动力学的最有前途的光学成像技术。的光学成像技术。全内反射荧光显微成像法不再采用扫描成全内反射荧光显微成像法不再采用扫描成像像,大大提高了成像速度大大提高了成像速度,可以满足实时成像可以满足实时成像的要求的要求;另一方面它的图像解释相对于近场另一方面它的图像解释相对于近场,干涉显微成像来说也较简单。干涉显微成像来说也较简单。现在全内反射荧光显微术已被广泛用于现在全内反射荧光显微术已被广泛用于实时观察单个肌浆球蛋白分子的运动实时观察单个肌浆球蛋白分子的运动实时观察单个肌浆球蛋白分子的运动实时观察单个肌浆球蛋白分子的运动单个蛋白分子对之间的荧光共振能量转移单个蛋白分子对之间的荧光共振能量转移单个蛋白分子对之间的荧光共振能量转移单个蛋白分子对之间的荧光共振能量转移( ( FRET)FRET) ATP ATP 酶的翻转酶的翻转酶的翻转酶的翻转 聚合物内单个分子的结构变化聚合物内单个分子的结构变化聚合物内单个分子的结构变化聚合物内单个分子的结构变化生物质膜附近的神经分泌腺的颗粒运动生物质膜附近的神经分泌腺的颗粒运动生物质膜附近的神经分泌腺的颗粒运动生物质膜附近的神经分泌腺的颗粒运动全内反射荧光显微术的发展一方面会在加强传统优势的基础上，即动态动态观察生物大分子的结构、相互作用、物质的分泌，同时在不断的改进物镜和CCD相机的性能基础上进一步同其他仪器的结合，更多的用在生物细胞活体方面的研究。 1.全内反射荧光显微术全内反射荧光显微术在生物单分子科学中的应用在生物单分子科学中的应用 单分子荧光探测主要有三个问题：（1）单分子发出的荧光信号通常是很微弱的，所以要寻找一个足够灵敏的探测器。（2）由于拉曼散射，瑞利散射和杂质荧光等产生的背景光，极大的干扰了信号光的探测。所以应该尽量降低背景激发光。（3）本体溶液产生的焦点荧光之外的背景光。 这些问题都可以利用全内反射荧光显微成像系统来解决 全内反射荧光显微镜可以直接对细胞表面的过程进行观测，而不受到来自细胞内深层区域信号的干扰。 全内反射荧光显微术是研究细胞表面科学如生物化学动力学、单分子动力学的最有前途的光学成像技术利用物镜型全内反射荧光显微镜观察活细胞表面示意图。单个的生物大分子的荧光分子特征和动态构像变化要运用到棱镜型的全内反射荧光显微术。如用环境敏感荧光基团标记的肌球蛋白，然后用分光镜检测。肌球蛋白分子上荧光基团发出的荧光光谱随着时间的起伏现象，说明了自发的肌球蛋白单分子构像改变。2.蛋白分子相互作用蛋白分子相互作用 通过荧光标记的分子共同定位运用全内反射荧光显微镜对分子间相互作用可以直接观察，荧光共聚焦能量转移也能够检测到。分子伴侣蛋白GroEL和伴侣辅助分子(co-chaperon)GroES或者其底物乳球蛋白的相互作用已经在单分子水平进行了很好的研究。单配对荧光共聚焦也可以用在单分子水平生物大分子相互作用的成像。3.离子通道研究 离子通道通过负责神经，肌肉兴奋性细胞的质膜离子通道通过负责神经，肌肉兴奋性细胞的质膜调节离子电流和电化学势。调节离子电流和电化学势。单分子水平通道电流记录可以通过使用膜片钳方单分子水平通道电流记录可以通过使用膜片钳方法来检测各种通道的电特性。法来检测各种通道的电特性。目前，已经发展了一种同时可以测电流和荧光信目前，已经发展了一种同时可以测电流和荧光信号的实验系统。荧光标记的离子通道蛋白包埋到号的实验系统。荧光标记的离子通道蛋白包埋到平面脂双层中，然后用物镜型全内反射荧光显微平面脂双层中，然后用物镜型全内反射荧光显微镜观察。利用全内反射荧光显微镜结合后来发展镜观察。利用全内反射荧光显微镜结合后来发展的荧光共振能量转移或者双视角的光镜可以看到的荧光共振能量转移或者双视角的光镜可以看到离子通道与其配基或者调节子之间的相互作用，离子通道与其配基或者调节子之间的相互作用，同时可以在体内跟踪构像变化与离子电流。同时可以在体内跟踪构像变化与离子电流。 4.吸附用于DNA大分子在液-液、固-液界面的单分子吸附行为 。全内反射荧光显微镜下拍到全内反射荧光显微镜下拍到的位于表面的的位于表面的Actin-YFPActin-YFP和和Tubulin-YFPTubulin-YFP蛋白分子图蛋白分子图分别在全内反射荧光显微镜下（左）和分别在全内反射荧光显微镜下（左）和一般荧光显微镜（右）拍到的一般荧光显微镜（右）拍到的Dil-stainedneuron,Dil-stainedneuron,细细胞。胞。全内反射荧光显微镜（全内反射荧光显微镜（全内反射荧光显微镜（全内反射荧光显微镜（TIRFMTIRFM）是研究）是研究）是研究）是研究紧贴固体紧贴固体紧贴固体紧贴固体平面支撑物的细胞膜平面支撑物的细胞膜平面支撑物的细胞膜平面支撑物的细胞膜的技术，但是正因为膜与固的技术，但是正因为膜与固的技术，但是正因为膜与固的技术，但是正因为膜与固体支撑物具有相互作用，以及消逝波强度的指数体支撑物具有相互作用，以及消逝波强度的指数体支撑物具有相互作用，以及消逝波强度的指数体支撑物具有相互作用，以及消逝波强度的指数性下降而导致单分子信号的指数性下降，使得对性下降而导致单分子信号的指数性下降，使得对性下降而导致单分子信号的指数性下降，使得对性下降而导致单分子信号的指数性下降，使得对结果的解释具有一定的困难性。结果的解释具有一定的困难性。结果的解释具有一定的困难性。结果的解释具有一定的困难性。因此将全内反射荧光显微术与其它的显微成像技因此将全内反射荧光显微术与其它的显微成像技因此将全内反射荧光显微术与其它的显微成像技因此将全内反射荧光显微术与其它的显微成像技术相结合来研究将是未来发展的一个新的方向。术相结合来研究将是未来发展的一个新的方向。术相结合来研究将是未来发展的一个新的方向。术相结合来研究将是未来发展的一个新的方向。 The application of the total internal reflection fluorescence microscopy解依荻全内反射全内反射应用的核心用的核心问题l全内反射全内反射应用的核心用的核心问题是是制作与制作与电子子显微微术（EMEM）切）切片尺寸相当的光学切片。片尺寸相当的光学切片。共焦技共焦技术 VS.VS.全内反射技全内反射技术l共焦技术：单光子或双光子的共焦系统层析深度分别为500800nm。l全内反射显微术: 典型的垂直照明深度100nm。l结论：薄的光学层析层切片信噪比强； 细胞的光损伤和光漂白影响也很小。全内反射的全内反射的应用用l在生物单分子研究中的应用l直接观察细胞表面的生命活动,而不受细胞深层区域信号的干扰.l全内反射荧光显微术的荧光激发深度只在200的薄层范围内,从而成为研究细胞表面科学如生物化学动力学、单分子动力学的最有前途的光学成像技术。全内反射的全内反射的应用比用比较l与其他生物单分子研究技术的比较全内反射荧光显微镜（TIRFM）共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）双光子激光扫描显微镜（TPLSM）全内反射的全内反射的应用比用比较l l全内反射全内反射全内反射全内反射荧荧光光光光显显微微微微镜镜（TIRFMTIRFMTIRFMTIRFM）l全内角反射荧光显微镜（total internal reflection fluorescence microscope，TIRFM），利用光线全反射后在介质另一面产生衰逝波的特性，激发荧光分子以观察荧光标定样品的极薄区域，观测的动态范围通常在200 nm以下。因为激发光呈指数衰减的特性，只有极靠近全反射面的样本区域会产生荧光反射，大大降低了背景光噪声干扰观测标的，故此项技术广泛应用于细胞表面物质的动态观察。 全内反射的全内反射的应用比用比较l l共聚焦激光共聚焦激光共聚焦激光共聚焦激光扫扫描描描描显显微微微微镜镜（CLSMCLSMCLSMCLSM）和双光子激光双光子激光双光子激光双光子激光扫扫描描描描显显微微微微镜镜（TPLSMTPLSMTPLSMTPLSM）则是可以检测细胞质内荧光的技术。lCLSM的重要优势在于，它提供了仅从单光学薄层收集光波的可能性。与聚焦平面共轭的针孔定位（即共焦）可避免来自检测器之外的光，即从聚焦平面以外的其它地方反射/发射过来的光。但是这个光学薄层的厚度大约为500-800nm，要大于全内反射荧光显微镜的光学薄层的厚度（200nm）。lTPLSM对生物系统和体内细胞性质具有高的分辨率，如细胞器，细胞连接，细胞内钙离子浓度，细胞膜流动性。 生物生物单分子分子荧光光检测技技术的比的比较共聚焦激光扫描显微（CLSM）双光子激光扫描显微镜（TPLSM）全内反射荧光显微镜（TIRFM）共同点检测细胞荧光物质的技术空间分辨荧光分析技术区别点CLSM提供了仅从单光学薄层收集光波的可能性。与聚焦平面共轭的针孔定位（即共焦）可避免来自检测器之外的光，即从聚焦平面以外的其它地方反射/发射过来的光。不要求高于衍射极限的分辨率 TPLSM对生物系统和体内细胞性质具有高的分辨率。双光子激发能探索活细胞内各种分子的实时动态，能实现在样品中的高度精确定位。减少了光损伤，特别对需要条件温和的生物体系有利TIRFM具有高度的界面（表面）特异性，可有效排除本体干扰，获取界面信息。纵向分辨力极高，特别适用于表面或界面单分子的测定。全内反射荧光法相对简单，费用低廉。表面或界面单分子的测定展望前景展望前景l不论是对物理成像学家还是对细胞生物学家而言，全内反射荧光显微术均是一项新的技术。它的未来发展将是怎样的呢？l它将向着两个前沿方向发展：技术上的进一步创新和在新的细胞生命科学领域中的应用。这意味着在一方面全内反射荧光显微术将继续和其它的显微成像技术，如荧光相关光谱技术，荧光寿命成像技术以及原子力显微术相结合；另一方面，继续寻求成像原理上的突破，这也正是目前有待积极探索的课题。全内反射全内反射荧光光显微微镜的改的改进1. 光电探测设备探测效率和探测速度的提高l新型的物镜透镜、聚光器和其它材料的引入2. 单分子染色技术的发展新型的物新型的物镜透透镜、聚光器和其它、聚光器和其它材料的引入材料的引入l超高的信噪比，能超高的信噪比，能够得到完美的得到完美的图像像l崭新的UIS2物镜的信噪比优越，高于现有物镜50%。这种物镜的新特性还包括精选了低自发荧光玻璃（通过全反射镀膜和连接材料，显著减少了自发荧光），提高了数值孔径，增强了信号亮度。UIS2系统在弱激发光下，能够有效探测极弱荧光，从而建立了活细胞荧光成像的新标准。新型的物新型的物镜透透镜、聚光器和其它、聚光器和其它材料的引入材料的引入l拥有更有更宽波波长范范围内的高透内的高透过率率l内置物镜采用UW多层镀膜技术，能有效消除超宽谱带上的反射，在可见光到近红外光的波长范围内能够实现平坦的高透过率，在近红外和紫外范围内的透过率显著提高。提高较宽波长范围内的性能使它非常适合当今最需要的研究用途。 新型的物新型的物镜透透镜、聚光器和其它、聚光器和其它材料的引入材料的引入l有效消除直到近有效消除直到近红外范外范围的色差的色差l杰出的超级复消色差特点有效地消除了从可见光谱直到1000nm范围内的色差, 意味着从紫外到红外范围内的成像都可以只用一个物镜实现。这一系列物镜在使用覆盖很宽谱带的荧光进行多色观察时，可以获得出色的清晰图像而不产生颜色偏移。 新型的物新型的物镜透透镜、聚光器和其它、聚光器和其它材料的引入材料的引入l双双层多光口多光口设计保保证了了输入入/ /输出灵活性出灵活性新型的物新型的物镜透透镜、聚光器和其它、聚光器和其它材料的引入材料的引入l后上光口后上光口l后上光口不改变载物台高度，所以不影响镜架稳定性这一光口可做光路输入口，可装一个附加荧光照明器l右侧光口右侧光口l右侧光口装置（IX2-RSPC-2:可选件，视场数：16）带有一个结像透镜，可以安装一个C型接口CCD照相机。l后下光口后下光口l能够安装冷CCDDP30BW与同类设备。l左侧光口左侧光口l在这一光口上，原始图像平面距显微镜镜架102mm，具有很大的灵活性，用以安装滤色镜转盘或者超低或5X照相机适配器。与双光口视频适配器结合，能够获得两个原始图像。（可选件）l底光口底光口使用IX2-TVR（T型接口），获得原始图像。新型的物新型的物镜透透镜、聚光器和其它、聚光器和其它材料的引入材料的引入l提高了近提高了近红外透外透过率率lIX2系列采用UIS2 光学系统，提高了侧光口、后光口和底光口的红外透过率，能够提供多方面的高性能，以适应未来研究的需要。 展望前景l双色和多色全内反射荧光激发在国际上刚崭露头角。在生物学的应用上,由于全内反射荧光成像的独特优势，它将成为细胞基底接触区域内的丰富的细胞生命活动，如细胞膜内蛋白质的动力学过程，基底附近的细胞骨架，细胞运动等最强有力的探测方法。如细胞膜内蛋白质的动力学过程，基底附近的细胞骨架，细胞运动等。l我们有理由相信随着光电探测设备探测效率和探测速度的提高以及单分子染色技术的发展，全内反射荧光成像技术将越来越生动的把细胞内的生物世界展现在我们面前。