实验三植物RNA的分离纯化(LiCl沉淀法)一、实验原理总RNA包括线粒体RNA、叶绿体RNA、tRNA和mRNA。与DNA一样，RNA在细胞中也是以与蛋白质结合的状态存在。RNA分子主要存在于细胞质中，约占75%，另有10%存在于细胞核内，15%在细胞器中。RNA以rRNA的数量最多(80-85%)，tRNA 及核内小分子RNA占10%-15%，而mRNA 分子只占1%-5%。mRNA 分子大小不一，序列各异。 RNA提取一般使用蛋白质强变性剂有效抑制RNA酶活性，同时并使DNA变性，再通过有机溶剂反复抽提去掉蛋白质、多糖等物质，在RNA沉淀剂的作用下，针对性分离出RNA。 总RNA提取原则： 保持核酸结构的完整性； 排除其它分子的污染。1 1二、仪器设备 高速冷冻离心机、电子天平、冰箱三、材料及试剂 1.材料：植物任何部分的新鲜组织 2.试剂：水饱和酚(pH4.9)；苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)混合溶液；3mol/LNaAc(pH5.2)；RNA提取缓冲液：内含0.2mol/LTris-HCl(pH8.0)、0.4mol/LLiCl、25mmol/LEDTA和1%SDS；2mol/LLiCl；75乙醇；2 2无水乙醇；灭菌双蒸水(ddH2O，无Rnase)；氯仿。四、操作步骤四、操作步骤1取取植物材料0.5g，放入预冷的研钵中，加入0.1ml-巯基乙醇。2液氮中充分研磨，中间可补充液氮，直到将材料磨成粉末。3将粉末迅速分装到3-5个1.5ml离心管中，分别加入0.6ml提取液，剧烈振荡2-3min。4分别加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇混合液，振荡1min，冰上放置5min。54、12000g离心10min。6将上层水相转到对应的灭菌离心管中，加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇混合液，振荡混匀，室温下、12000g离心5min。3 37重复步骤6，直至无白色界面物质。8将水相转至对应的灭菌离心管中，加入等体积氯仿振荡混匀，以除去痕量的苯酚。9室温下、12000g离心5min。10将上层水相转移至对应的灭菌离心管中，加入1/10体积的NaAc(3mol/L,pH5.2)和2倍体积的无水乙醇，混匀，-70放置30min。114、12000g离心20min。12弃去上清夜，向沉淀加入0.3mlLiCl(2mol/L)，并振荡溶解，冰上静置1030min。4、12000g离心20min。13弃去上清液，加入0.3ml灭菌双蒸水(ddH2O，无RNase)，振荡使沉淀溶解。14加入1/10体积的NaAc(3mol/L,pH5.2)和2倍体积的无水乙醇，混匀，-70放置30min。154、12000g离心20min。4 416弃去上清液，沉淀分别用70%乙醇和无水乙醇1ml洗涤，并短暂离心。17小心吸去残留的乙醇，空气中凉干3min。18RNA用20-30l无菌水溶解，贮藏于-70备用。19RNA的浓度测定和纯度分析取2-5lRNA溶液稀释至100l，于紫外核酸蛋白检测仪上测定A260、A280和A320的OD值，并计算RNA浓度和得率。注：核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在注：核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm，对纯的，对纯的RNA来来说，OD260OD280为2.0，1个OD260约为40g/mlRNA。20RNA的完整性检测1.2%琼脂糖凝胶电泳在紫外检测仪下观察，完整的总RNA样品应呈现三条带：28S、18S、和5SrRNA。其中28SrRNA条带的亮度应该为18S5 5rRNA条带的1.5-2倍。反之，说明部分28SrRNA已经降解成18SrRNA。若无清晰条带，则说明样品RNA已严重降解；若加样孔内或孔附近有荧光区带，则说明有DNA污染。6 6【注意事项】【注意事项】1条件允许的实验室应专门辟出RNA操作区，离心机、移液器、试剂等均应专用，RNA操作区应保持清洁，并定期行除菌。2操作过程中应始终戴一次性手套，并经常更换，以防止手、操作过程中应始终戴一次性手套，并经常更换，以防止手、臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNA酶带到试管或污染酶带到试管或污染用具。用具。3避免在操作过程中说话聊天。4配制溶液用的酒精、异丙醇、Tris等应采用未开封的新瓶。5所有旧塑料制品都必须用0.5mol/L的NaOH处理10min，用双蒸水彻底冲洗，DEPC-H20浸泡过夜后灭菌。6所有的玻璃器皿均应在使用前于180的高温下烘烤6h或更长时间。7配制的溶液应尽可能的用0.1%DEPC在37处理12h以上，然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22m滤膜过滤除菌。7 78.无法用DEPC处理的用具可用氯仿擦拭若干次，这样通常可以消除RNA酶的活性。但氯仿会溶解某些塑料制品，应当注意。9有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温室温10min，然后用，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。水冲洗，晾干。10.DEPC有致癌的潜在嫌疑，操作时要小心仔细，一定要戴上手套，并且最好在通风橱中进行。11RNaseAwayTM试剂可以替代DEPC，操作简单，价格低，且无毒性。只需将RNaseAwayTM直接倒在玻璃器皿和塑料器皿的表面，浸泡后用水冲洗去除，即可以快速去除器皿表面的RNase，并且不会残留而干扰后继实验。12如果提取的RNA样品暂时不用，最好置于-70低温冰箱中保存，再次使用时应做RNA琼脂糖变性胶电泳分析，以检测RNA的完整性。8 8【常用的【常用的RNA酶抑制剂】酶抑制剂】1.焦磷酸二乙酯(DEPC)：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。变性，从而抑制酶的活性。2.异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。3.氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。4.RNA酶的蛋白抑制剂(Rnasin)：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。5.其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。9 9