免疫规划相关疾病血清学实验室检测河北省疾病预防控制中心免疫规划管理所梁勇梁勇1免疫规划相关疾病血清学检测概述1、乙肝表面抗原和乙肝表面抗体2、麻疹IgG抗体和IgM抗体检测3、风疹IgG抗体和IgM抗体检测4、白喉和破伤风凝集抗体检测5、百日咳凝集抗体和IgG抗体检测6、其它还包括乙型脑炎IgG、流行性脑脊髓膜炎IgG、脊髓灰质炎三型抗体检测等2从检测类别上分类1、免疫成功率检测（初免儿童抗体水平检测）2、人群抗体水平检测（涉及到多个年龄组）3、疾病和疫情的实验室（血清学）诊断包括麻疹、风疹等发热岀疹性疾病诊断、白喉和破伤风以及百日咳的实验室诊断等。3初免和健康人群检测样品的获得1、一般情况下都应通过抽样获得被调查对象，然后，对调查对象采集静脉血。2、常见的抽样方法：单纯随机出样抽签法和随机数字表法系统抽样整群抽样分层抽样多阶段抽样4常用的抽样方法多阶段抽样组群抽样批质量保证抽样接种率调查抽样方法按容量比例概率抽样(PPS)与批质量检验抽样（LQAS）相结合的方法 特点：分层多阶段抽样；先抽乡级单位，再抽村级单位，最后再抽调查对象，采集血标本。5回避1、随意确定一个乡或村；2、在乡级接种门诊等候随便采血；3、在村级由村医带领（随意）到几个家庭采血；4、到学校任意找一个班级或几个班级随意采集血；5、以上这样做，既浪费资源，结果也无代表性。6制定采血调查表按照调查目的制定采血登记表，一般采用过录表。有时使用个案表，如病例调查。调查时，一定要注意被调查者信息的收集和保持完整。有时为了达到某一目的，按照过去调查时掌握的情况，人为确定某些“好的”和“不好的”乡或村进行血清学调查。7血标本的采集现一般多采用静脉采血，采血量一般3-5ml，能满足1.5-2.5ml的血清量，一个人份可以同时能满足检测多项指标的要求。同时，对于有重大意义的血清标本，还同时能够满足备份的要求。尤其是对于2-5岁以下幼儿的采血，每个县级单位一定要有2-3名技术数量的人员，才能够保证血标本的采集。采血时一定要制定编号规则，统一编号，血标本采集后及时标号。8血清标本的收集和保存血标本采集后一定要及时分离血清，切不可长时间在常温下放置，否则可能会导致污染，废弃。血标本采集后最好是放在室温凝集，及时离心后，分离出血清，血清标本-20保存。血标本采集后4 保存可能要在一定程度上会降低抗体滴度。如果需要过夜最好是放在4 保存。9血清标本的收集和保存1、血清标本尽量避免反复冻融，反复多次冻融也会降低抗体滴度；2、必要时将分成几份分别保存，可避免反复冻存。3、血清标本分离后，及时将血标本上的号码转移至血清标本上，避免号码混淆，并及时与采血单核对。10采血和血清收集用品1、采血现多用一次性采血针（针连着管）和采血管（无菌）；2、收集血清多用1.5ml尖底、旋盖、管体尖底、旋盖、管体和旋盖带链接和旋盖带链接的离心管盛放血清。3、当血清较多时，也可使用2-3ml冻存管。11血清学检测环境条件及设备1、生物安全二级实验室。2、仪器设备：培养箱、冰箱、冰柜、酶标仪（405nm、450nm、490nm、650nm)、洗板机、加样器（移液器）。3、加样器：单道和多道（8道和12道）单道：1-10l、1-20l、5-50l、5-200l多道：5-50l、5-200l等。12血清学检测的其它用品1、振荡器、离心机、水浴箱、天平、高压锅2、吸管、烧杯、量筒等3、常用化学试剂13免疫监测及其评价详见Word文档。14ELISA实验的质量控制详见pdf文件。15乙肝表面抗原和乙肝表面抗体检测1、国内多家试剂公司生产，灵敏度和特异度、重复性等指标各不相同。2、国内多数公司生产的试剂大多是过关的，我们现多使用北京万泰生物药业股份有限公司生产的。3、考察一家公司生产的试剂可以从灵敏度和特异度、重复性三个指标来考察。4、制备自己的质控血清，以检查不同厂家、不同批次的试剂的稳定性和可用性。16乙肝表面抗原和乙肝表面抗体检测1、结果影响因素 试剂稳定性； 取样和血清本身如融血、脂类成分、药物成分等； 操作者人为误差和误操作； 仪器设备稳定性； 不遵守操作规程，等 实验中影响结果最多见的就是血脂。17乙肝表面抗原和乙肝表面抗体检测2、HBsAg阳性结果的对待 对于HBsAg阳性结果一定要谨慎； 检查血清（肉眼观察的）状态； 查看其HBsAb结果； 双份（孔）重复检测； 必要时更换试剂重复检测； 相隔一定时间再次采血双孔双项目重复检测。18麻疹IgG抗体检测麻疹IgG抗体检测原始试剂：指中国CDC国家麻疹实验室生产的自己包被酶标板的半定量的试剂；试剂主要成分：麻疹病毒抗原、细胞对照抗原、酶标记抗抗体、底物（邻苯二胺，OPD）；其他：无水碳酸钠、碳酸氢钠、氯化钠、磷酸氢二钠、柠檬酸、双氧水、吐温-20、硫酸等。检测方法：详见Word文档19麻疹IgG抗体检测麻疹IgG抗体检测试剂盒：国内过关的试剂盒不多，且多为定性试剂，结果只能提供抗体阳性率，不能计算免疫水平，结果提供的信息较少；目前，过关的国外试剂，而且国内常使用的是德国维润赛润公司生产的试剂盒，实验只需要一孔既可以定性和定量检测麻疹抗体水平，结果以mIU/ml表示；20维润赛润麻疹IgG结果1、抗体150mIU/ml没有保护水平； 抗体200mIU/ml达到保护水平； 抗体在150200之间为可疑结果。2、既可以计算阳性率，亦可以计算GMT-抗体几何平均低度（平均水平）。3、试剂重复性与上面介绍的国内（nmlab)试剂相当；4、结果水平与上面介绍的国内（nmlab)试剂亦相当；5、但GMT的计算较麻烦，但借助于计算机还是比较容易的。6、试剂价格较高，96T一般要1800元。21麻疹IgM抗体检测1、原始试剂来自nmlab，试剂需要自己包被，整个实验需要2-3天，实验者要求经过正规培训，结果不好控制，难度较大，现已不再使用，但熟悉整个实验操作对于使用试剂盒来说是有很大帮助的。2、现多使用试剂盒检测，国产和进口的都有，但价格悬殊。3、现国内麻疹实验室网络（国家、省、市级）多使用的有：广东珠海海泰、北京贝尔试剂；进口德国维润赛润试剂等22麻疹IgM抗体检测4、从检测原理上来划分： 捕获法和间接法两种。 捕获法应该是优于间接法，只是间接法在实验时加入了非特异性因子吸附剂，以去除血清中的类风湿因子非特异性因子。 国内试剂都是捕获法，维润赛润是间接法。5、来自nmlab的原始试剂检测方法详见Word讲稿。6、来自珠海海泰的试剂检测方法详见Word讲稿。23风疹IgM抗体检测风疹IgM抗体检测试剂：1、原来是原始状态的试剂；现多采用试剂盒进行检测；2、目前国产试剂盒据我所知只有深圳科润达公司生产的试剂盒可以使用；进口的试剂就是德国维润赛润的试剂。目前这两家公司的试剂在全国麻疹风疹实验室网络中广泛使用。3、风疹IgG试剂我没有使用过，大家感兴趣可以自己去筛选。如德国维润赛润的试剂。24风疹IgM抗体检测4、风疹IgM抗体检测与麻疹IgM抗体检测一样，也有间接法和捕获法。现将深圳科润达公司生产的试剂检测方法简述如下。5、风疹IgM抗体检测主要用于麻疹疑似病例麻疹IgM抗体阴性血清的检测，以及高度怀疑为风疹暴发流行疫情的实验室诊断。6、详见Word文档。25白喉、破伤风凝集抗体检测1、白喉、破伤风凝集抗体检测方法一样，只是致敏血球不一样。2、目前，国内只有北京生研所流行病室和中国药品生制品鉴定所生产该试剂，但每年非常不规范，时常断货。不能保证正常血清学监测之需要。3、试剂主要是白喉类毒素和破伤风类毒素致敏的致敏血球和对照血球，致敏血球是两种，对照血球是一种，一般都以绵羊红细胞作为载体。4、检测方法详见Word文档。26百日咳凝集抗体检测方法1、百日咳凝集抗体检测方法现在多使用微量凝集实验，这主要是针对以前全细胞百白破疫苗，即针对百日咳菌体抗原所涉及的实验。2、随着无细胞百白破疫苗的广泛推广和使用，其相应的抗原和抗体也随之发生改变，所以检测方法也要发生改变，只是目前实验方法和检测试剂需要筛选。3、有关微量凝集试验方法和酶标实验方法详见Word讲稿。27乙型脑炎IgG、流行性脑脊髓膜炎IgG、脊髓灰质炎抗体检测1、乙型脑炎IgG、流行性脑脊髓膜炎IgG、脊髓灰质炎抗体检测是2008年国家要求省级考核市级绩效考核的内容。2、有关三类抗体的详细检测方法，在绩效考核中没有做出详细规定，对于前两种抗体现多采用ELISA方法进行检测，国内有多家试剂公司生产，只是质量各不相同，大家可以自己进行筛选。两种检测方法都是定性检测。3、结合自己所掌握的实验技术和方法，以及对调查对象的详细的接种情况，结果情况等综合进行考察。28脊髓灰质炎抗体检测1、这方面的检测做的比较少，目前常常使用的方法有两种：脊髓灰质炎中和抗体（三型）和ELISA法检测三型IgG抗体。2、脊髓灰质炎中和抗体（三型）检测比较复杂，需要培养细胞，对人员和设备要求较高。该方法是定量检测。3、 ELISA法检测三型IgG抗体相对要简单得多，目前国内有成品试剂盒出售，只是定性检测，一般方法简单。4、有关两种检测方法详见Word文档。29结核菌素试验在人体身上进行的试验，实验材料有两种：1、结核菌素结核菌素试验（OT实验） OT实验已被淘汰。2、结核菌素纯蛋白衍化物实验PPD实验。3、实验详见Word文档。30谢谢！联系方式：河北省CDC 免疫规划管理所地 址：石家庄市槐安东路97号邮 编：050021电 话：0311-86573348/47邮 箱：hbmvlab126.com31