第六章第六章 细菌的遗传变异细菌的遗传变异 主要内容：主要内容：主要内容：主要内容：一、细菌遗传的物质基础一、细菌遗传的物质基础二、基因突变二、基因突变三、基因的转移与重组三、基因的转移与重组四、研究细菌遗传变异的实际意义四、研究细菌遗传变异的实际意义第一节第一节 细菌遗传的物质基础细菌遗传的物质基础1 1、 基因组基因组 (genome)(genome)细菌的基因组位于核体，是遗传的主要物质基础。核体又称染色体(chromosome)是由两条环状双螺旋DNA长链组成，含细菌的遗传基因，控制细菌的遗传与变异。细菌染色体DNA以半保留方式进行复制。故子代写亲代细菌的性状相同。倘若在DNA复制中，子代DNA发生改变，便会出现变异。2 2、质粒、质粒 (Plasmid)(Plasmid)质粒是细菌染色体外的遗传物质，多为环状双螺旋DNA分子。质粒可以自身复制，随宿主菌分裂传到子代菌体。在一定条件下，质粒可以转移，也可丢失。质粒是自行复制单位，有的需与核质染色体的复制同步，称为严紧型复制严紧型复制。编码细菌各种重要的生物学性状。1 F质粒：编码性菌毛的质粒称致育质粒或F质粒 ，具有F质粒的细菌有性菌毛，为雄性细菌；无F质粒的细菌无性菌毛，为雌性细菌，该质粒与细菌的有性结合有关。2 毒力质粒：编码细菌各种毒力因子的质粒统称毒力质粒或Vi质粒 。如致病性大肠杆菌在黏膜上定居及产生毒素的能力可由不同质粒编码，其中K质粒编码对黏膜具有黏附活性的菌毛，ST质粒与LT质粒分别编码耐热肠毒素和不耐热肠毒素。细菌对抗菌药物或重金属盐类的抗性则由R质粒所决定。一个质粒可同时具有几种编码功能。质粒可以在细菌间转移，当质粒从一个细菌转移至另一个细菌时，携带的性状也随之转移。质粒的转移不仅可以发生花同种、同属的细菌之间，有的甚至还可以在不同种属的细菌间进行。按其转移的特性时将质粒分为二类:接合性质粒与非接合性质粒。2、穿梭载体是一类特殊的质粒，可在某种属关系差异较大的微生物中转移，例如在大肠杆菌与酵母之间。利用它可携带质核或真核微生物的外源序列。3、转座因子(transposableelement)近年来发现微生物的某些DNA片段作为一个独立单位可在染色体上移动，此种移动甚至可发生在不同种细胞之间。这种可移动的DNA片段称之为转座因子。细菌的转座因子有三种类型:插入序列（IS）、转座子(Tn)以及某些特殊的噬菌体，例如Mu是促变噬菌体的简称。4、毒力岛(pathogenicity island，PAI) 是20世纪90年代提出的一个新概念。PAI是指病原菌的某个或某些毒力基因群某个或某些毒力基因群，分子结构与功能有别于细菌染色体，但位于细菌染色体之内，因此称之为“岛”。PAI虽然是染色体的DNA片段，但两端往往具有重复序列与插入元件，其G+Cmol%及密码使用与细菌染色体有明显差异，分子量较大，多为3040kb，也有达100kb者。遗传变异的物质基础遗传变异的物质基础三个经典实验证明核三个经典实验证明核酸是微生物遗传物质酸是微生物遗传物质转化实验转化实验噬菌体感染实验噬菌体感染实验植物病毒的重建实验植物病毒的重建实验杀死 无菌落生长 体外培养 活菌 体外培养 菌落 菌落多菌落少 体外混合培养杀死 活菌 转化实验（2）细菌培养实验大量R菌落活R菌S菌无细胞抽提液+活R菌+S菌DNAS菌落转化实验转化实验（3 3）S S型菌无细胞抽提液试验型菌无细胞抽提液试验S菌PrS菌多糖R菌落活R菌+Cncnc-micro 植物病毒蛋白质和RNA可以人为地分开,同时又可把它们重新组合成具感染性的病毒.植物病毒的重建实验 甲乙r 感染症状同甲病毒；分离得到甲病毒 乙甲r 感染症状同乙病毒；分离得到乙病毒 Cncnc-microTMVHRV（TMV变种）HRVTMV原始株原始株 拆开拆开 重建重建 感染感染 分离纯化分离纯化 植物病毒的重建实验 染色体染色体基因基因基因基因DNA基因是一段基因是一段DNA第二节第二节 基因突变基因突变一、基因突变的概念及种类：一、基因突变的概念及种类：1 1、概念：、概念：基因突变简称突变，是变异的一种，指生物细胞遗传物质DNA分子结构突然发生了稳定的可遗传的变化。它是生物进化的一个重要因素。2 2、种类：、种类：细菌与一般生物细胞一样可发生突变，其突变也可按发生改变的范围大小，分为染色体畸变和点突变。二、细菌常见的变异现象二、细菌常见的变异现象1 1、菌落形态变异、菌落形态变异分为两种类型，即菌落表面光滑、湿润，边缘整齐的光滑型（S型）和菌落表面粗糙、枯干，边缘不整齐的粗糙型(R型)。在一定条件下，光滑型菌落可变为粗糙型，称为SR变异。SR变异，经常伴随着S型抗原的丧失和病原菌毒力由强变弱等性状的改变。2、形态结构变异常见的有细胞壁缺陷变异(细菌L型等)、荚膜变异或鞭毛变异等。3-6%食盐鼠疫杆菌多形态性(衰残型)。琼脂培基形态结构变异青霉素、溶菌酶正常形态细菌L型变异抗体或补体(部分或完全失去胞壁)正常霍乱弧菌霍乱弧菌L型形态结构变异特殊结构的变异42-43炭疽杆菌失去形成芽胞能力,毒性10-20天降低变形杆菌（H）1%石炭酸（O）迁徙生长单个菌落鞭毛变异3 3、抗原变异、抗原变异 由于细菌基因突变而引起其抗原结构发生改变的变异类型。 常见的抗原变异有： 菌体抗原变异 鞭毛抗原变异 （H-O变异） 荚膜抗原变异4 4、抗性变异、抗性变异是对某种化学药物或致死物理因子抗性的变异。如耐药性的产生、对多种物理因素的抗性增强等。5 5、营养型变异、营养型变异主要引起营养缺陷型变异，即细菌丧失合成一种或几种生长因子的能力，无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型。这种突变对研究细菌代谢产物的生物合成途径很有用处。此外，营养型变异菌株可作为杂交、转化、转导和原生质体融合等研究中的标记菌种。6 6、毒力变异：毒力增强或减弱、毒力变异：毒力增强或减弱毒力是病原菌特有的一种生物学性状。在自然条件下，不仅不同菌株的毒力有所不同，就是同一菌株在不同条件下也表现出不同的毒力。在某种传染病的发病初期，从患病动物体内分离出来的菌株毒力较强，然而在流行末期分离到的细菌毒力大为减弱。毒力强的菌株在体外连续传代改变培养条件后，毒力往往减弱，而通过易感动物又能便毒力减弱的菌株恢复毒力。 细菌毒力减弱的方法细菌毒力减弱的方法 （1）长时间在体外连续培养传代 病原菌在体外人工培养基上连续多次传代后，毒力一般都能逐渐减弱乃至失毒力。 （2）在高于最适生长温度条件下培养 例如炭疽I型和号疫苗，均是将炭疽杆菌强毒株在4243培养传代育成。 （3）在含有特殊化学物质的培养基中培养 如广为采用的结核病卡介苗 (BCG)，系将牛型结核杆菌在含有胆汁的马铃薯培养基上每15天传1代，持续传代13年后育成。 （4）在特殊气体条件下培养 如无荚膜炭疽芽孢苗是半强毒菌株在含50%动物血清的培养基上，在50%CO2的条件下选育的。（5）通过非易感动物 如猪丹毒弱毒苗 (GC42 )系将强致病菌和株通过豚鼠370代后，又通过鸡42代选育而成。（6）通过基因工程的方法 去除毒力基因或用点突变的方法使毒力基因失活，可获得无毒力菌株或弱毒菌株。但对多基因调控的毒力因子较难奏效。 细菌毒力增强的方法细菌毒力增强的方法在自然条件下，回归易感动物是增强细菌毒力的最佳方法。易感动物既可是本动物，也可是实验动物。特别是易感实验动物，已广泛用于增强细菌的毒力，如多杀性巴氏杆菌通过小鼠，猪丹毒杆菌通过鸽子等。 三、诱发细菌变异的方法三、诱发细菌变异的方法诱发突变是应用人工方法使细菌增殖和复制DNA时出现 “错误”， 从而育成人类需要的细菌变异品系。如下介绍常用的诱变方法及其致突变的机制。 （一）（一） 物理方法物理方法包括温度及各种射线。1 1、温温度度：温度诱发基因突变的机制似乎是专一对GC碱基对的作用。包括使C脱氨基转换为尿嘧啶(U)，在复制中造成GGAT转换;以及引起G-脱氧核糖键的移动，从而在DNA复制过程中出现包括两个G的碱基对，在再一次复制中造成GGCG颠换。2 2、辐辐射射：辐射的诱变作用一般认为有直接作用和间接作用两个方面。前者是指辐射直接作用于染色体，包括引起DNA骨架断裂所造成的染色体畸变和引起复制差错。间接作用是使染色体以外的细胞物质发生变化，再由这些物质作用于染色体引起突变;它包括碱基类似物的形成及其突变诱发作用，和电离辐射引起过氧化氢和游离基的产生以及它们诱发突变。（二）化学方法（二）化学方法常用的化学诱变剂有5溴脱氧尿苷（ UBr ）、5-氟脱氧尿苷、2-氨基嘌呤、8-氮鸟嘌呤、亚硝酸、羟胺、烷化剂（B丙酸内酯和芥子气等）、亚硝基胍、丫啶橙染料 (丫啶黄、丫啶橙、原黄素等)、一系列烷化剂和丫啶类结合的化合物、溴化乙锭等。它们的作用机制复杂而各有差异，总的说来主要有以下几方面。 1.取代碱基参入DNA，从而使DNA的某些碱基对发生置换。例如UBr是T的结构类似物，它通常以酮式出现，能代替T与A形成氢键而配对。2. 使碱基发生化学变构，从而引起DNA的某些碱基对发生置换。例如亚硝酸对碱基有氧化脱氨基作用，可以便C成为U与A配对，或A成为次黄嘌呤(H)与C配对，从而引起DNA的某些碱基对发生置换突变。 3.插入DNA相邻的碱基之间，引起移码突变。在邻近的两个嘌呤碱基之间插入丫啶染料分子，可引起DNA复制时碱基增添或缺失的错误，造成密码子的移码，出现基因突变。 4.引起DNA分子断裂而诱发染色体畸变。例如许多烷化剂 (氮芥、硫芥、环氧乙烷等)除能诱发点突变以外，还能诱发染色体畸变。 （三）生物学方法（三）生物学方法利用各种生物学的方法可诱使微生物发生变异，使细菌发生毒力等性状的改变，获得性能良好的菌株。1 1、增强毒力、增强毒力 连续通过易感动物，可使病原菌毒力增强。有的细菌与其他微生物共生，或被温和噬菌体感染，也可增强毒力。例如产气荚膜梭菌与八叠球菌共生时毒力增强;肉毒梭菌当被温和噬菌体感染时，方产生毒素。 2 2、减减弱弱毒毒力力 病原菌毒力自发减弱的现象，常见于传染病流行末期所分得的病原菌株。人工减弱病原微生物的毒力通常使用病原菌通过非易感动物、鸡胚等方法。如将禽霍乱强毒菌株通过琢鼠190代后，再经鸡胚传40代，育成禽霍乱弱毒菌株。无论自然变异弱毒株或人工培育的变异弱毒株，均由于DNA上核甘酸碱基顺序的改变的结果。第三节第三节 基因的转移与重组基因的转移与重组细菌是单细胞生物，以二分裂方式进行无性繁殖，子代只有从一个亲代获得遗传物质，在某种情况下，两个不同性状细菌的基因可以转移到一起，经过基因间的重组，形成新的遗传型个体。细菌的基因转移和重组的主要形式有转化、转导、接合、原生质体融合和转染。 转化转化因子（transformingprinciple）在转化过程中，转化的DNA片段称为转化因子，分子量小于107，最多不超过1020个基因。感受态（competence）受体菌只有处于感受态时，才能摄取转化因子。细菌处于感受态是因为其表面有一种吸附DNA的受体.转化转化因子吸附在受体菌表面受体上，然后再被摄入。解链，一链进入受体菌，另一链为进入提供能量。重组。DNA复制重组菌繁殖后，获得新的性状的细菌称为转化菌的突变株。转化接合（接合（conjugation）接合是细菌通过性菌毛相互连接沟通，将遗传物质（主要是质粒DNA）从供体菌转移给受体菌。接合性质粒：能通过接合方式转移的质粒称为接合性质粒，F质粒、R质粒、Col质粒和毒力质粒。E.colistrainsundergoingconjugation(TEMx27,700)接合接合F+F-F+F-F+F+F+F+DonorRecipient接合接合R质粒的接合日本首先分离到抗多种药物的宋内志贺菌多重耐药株，多重耐药性很难用基因突变解释。健康人中大肠埃希菌30%-50%有R质粒，而致病性大肠埃希菌90%有R质粒。R质粒与耐药性有关，尤其与多重耐药性有关。耐药质粒从一个细菌转移到另一个细菌中。接合接合R质粒耐药传递因子（resistancetransferfactor,RTF）与F质粒相似，编码性菌毛的产生和通过接合转移耐药（r）决定子r-dir能编码对抗菌药物的耐药性，可由几个转座子连接相邻排列，如Tn9带有氯霉素耐药基因，Tn4带有氨苄青霉素、磺胺、链霉素的耐药基因，Tn5带有卡那霉素的耐药基因。 转导（转导（transduction）转导是以转导噬菌体为载体，将供体菌的一段DNA转移到受体菌内，使受体菌获得新的性状。普遍性转导（generalizedtransduction）局限性转导（restrictedtransduction）前噬菌体从溶原菌染色体上脱离，进行增殖，在裂解期的后期，噬菌体的DNA已大量复制，在噬菌体DNA装入外壳蛋白组成新的噬菌体时，在105107次装配中会发生一次装配错误，误将细菌的DNA片段装入噬菌体的头部，成为一个转导噬菌体。转导噬菌体能以正常方式感染另一宿主菌，并将其头部的染色体注入受体菌内。因被包装的DNA可以是供体菌染色体上的任何部分，故称为普遍性转导普遍性转导。普遍性转导普遍性转导普遍性转导普遍性转导普遍性转导普遍性转导完全转导外源性DNA片段与受体菌的染色体整合，并随染色体而传代，称完全转导流产转导外源性DNA片段游离在胞质中,既不能与受体菌染色体整合，也不能自身复制，称为流产转导局限性转导或特异性转导， 所转导的只限于供体菌染色体上特定的基因。如噬菌体进入大肠埃希菌。局限性转导局限性转导局限性转导局限性转导galbiogalbiogalbiogalbiobiogal第四节第四节 细菌遗传变异研究的实际意义细菌遗传变异研究的实际意义1 1、理论意义：、理论意义：用细菌进行的一系列遗传学实验，不仅揭示了细菌本身许多遗传变异的规律，而且推动整个分子遗传学的迅速发展。在微生物学领域内，细菌遗传变异的研究也有助于对其他有关问题的了解和发展，例如帮助了解微生物的起源和进化，微生物结构与功能的关系，原核生物性状的调节控制，以及推动微生物分类学的深入发展。 2 2、实实践践意意义义：在实践方面，细菌遗传变异的研究在以下若干方面也具有重大的实用意义。1 1 疾病诊断疾病诊断 在临床细菌学检查工作中，要作出正确的诊断，不但要熟悉细菌的典型特性，还要了解细菌的变异规律。 2 2 疾病预防疾病预防 菌苗接种是使机体建立特异性免疫，预防传染性疾病的有效措施，弱毒菌苗株都是病原菌的减毒变异株，有较好的免疫效果。 3 3 疾病治疗疾病治疗 在治疗细菌疾病用药时，应选择敏感的抗菌药物，并应防止耐药菌株的扩散。4 4 疾病诊断疾病诊断 5 基因工程基因工程基因工程是用人工方法将所需要的某一供体生物的DNA大分子提取出来，在离体的条件下用适当的工具酶切割，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一易生长、繁殖的受体细胞中，让外源遗传物质在其中“安家落户”，进行正常的复制 和表达，从而获得新的产物。它的主要操作步骤如下:(1)目的基因分离;(2)目的基因与载体DNA的体外重组，形成一个完整的有复制能力的嵌合体;(3)重组载体导人受体细胞，通常用转化的方法，导入能容纳外源载体的受体细菌。(4)复制与表达;重组载体在受体细胞内必须自主复制而获得扩增，以表达目的基因特有的遗传性状或产物，使之成为“工程菌”。应用这一技术可使细菌表达出需要的性状或产物。