反相高效液相色谱法分离芳香烃指导老师：唐玉莲背景背景v色谱法也称色层法，是色谱法也称色层法，是19061906年俄国植物学家年俄国植物学家Michael TswettMichael Tswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为由此得名为“色谱法色谱法”（Chromatography) Chromatography) 。v后来无色物质也可利用吸附柱色谱分离。后来无色物质也可利用吸附柱色谱分离。v英国生物学家英国生物学家MartinMartin和和SyngeSynge。他们首先提出了色谱塔板理。他们首先提出了色谱塔板理论，以及其远见卓识的预言。论，以及其远见卓识的预言。v19441944年出现纸色谱以后，色谱法不断发展，相继出现薄层色年出现纸色谱以后，色谱法不断发展，相继出现薄层色谱、亲和色谱、凝胶色谱、气相色谱、高压液相色谱谱、亲和色谱、凝胶色谱、气相色谱、高压液相色谱（HPLCHPLC）等。）等。色谱法的基本原理色谱法的基本原理v色谱法是利用混合物中各组分色谱法是利用混合物中各组分物理化学物理化学性质的差性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。移动而达到分离的目的。慢慢中等中等快快色谱分离色谱分离色谱分离色谱分离Temporal course淋洗液淋洗液色谱的基本概念色谱的基本概念v固定相固定相：固定相是色谱的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。v流动相流动相：在色谱过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为流动相。柱色谱中一般称为洗脱剂，薄层色谱时称为展层剂。 v分配系数分配系数 可由Langmuir方程得出 Kd-分配系数 q、c-溶质在固相和液相中的浓度v保留时间保留时间（tR）和保留体积（和保留体积（VR） 反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱过程的基本热力学参数之一。 高效液相色谱(HPLC)v 高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9107Pa）; 色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。高效液相色谱的特点v1高压：液相色谱法以液体为流动相（称为载液），液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。一般可达150350105Pa。：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达110ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于1h 。 3. 高效：近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。 ：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外，用样量小，一般几个微升。：气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于400 以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的 75% 80% ）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占7080%。 HPLC的分类v高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。v根据分离机制的不同，高效液相色谱法可分为下述几种主要类型： 液 液分配色谱法及化学键合相色谱、液 固色谱法 、离子交换色谱法 、离子对色谱法 、离子色谱法 、空间排阻色谱法 。v用不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似。其不同之处是高效液相色谱灵敏、快速、分辨率高、重复性好，且须在色谱仪中进行。v其中液 液分配色谱法及化学键合相色谱又分为：a. 正相液 液分配色谱法：流动相的极性小于固定液的极性。 b. 反相液 液分配色谱法: 流动相的极性大于固定液的极性。 反相色谱reversed phase chromatography, RPC固固定定相相：非极性的反相介质，即为疏水性介质(R1,R2多为甲基，R为C4，C8，C18烷基或苯基，其中C18硅烷化制备的试剂最多，统称为ODS Octadecyl silica)。烷基化密度：烷基化密度：45%，55%的羟基用的羟基用三甲基氯硅烷覆盖，使表面完全非极性化。溶质在介质上的分配系数处决于溶质的疏水性，疏水性大，溶质在介质上的分配系数处决于溶质的疏水性，疏水性大，m高。高。流流动动相相：极性有机溶剂的水溶液(甲醇,乙晴, 异丙醇、正丙醇和四氢呋喃等)洗脱：洗脱：有机溶剂增加。30m15m5mInfluence of Particle Size on the Separation effect应用：应用：主要应用于5000KD以下，特别是1000以下的非极性小分子物质的分离蛋白质：可以应用，但存在变性的危险。有机溶剂实验仪器及试剂v一、仪器v岛津LC-10AT型高效液相色谱仪v色谱柱：m，C18柱v注射器v二、试剂v流动相：V甲醇：V水：v苯、甲苯、苯酚(均为分析纯)v未知样品仪器组成v液相色谱仪的基本组成：进样系统、输液系统、分离系统、进样系统、输液系统、分离系统、检测系统和数据处理系统。检测系统和数据处理系统。 进样系统进样系统：一般采用隔膜注射进样器或高压进样间完成进样 操作，进样量是恒定的。这对提高分析样品的重复性是有益的。手动进样器或自动进样器。 输液系统输液系统：该系统包括高压泵高压泵、流动相贮存器流动相贮存器和梯度仪梯度仪三部分。高压泵的一般压强为l4744X107Pa，流速可调且稳定，当高压流动相通过层析柱时，可降低样品在柱中的扩散效应，可加快其在柱中的移动速度，这对提高分辨率、回收样品、保持样品的生物活性等都是有利的。流动相贮存错和梯度仪，可使流动相随固定相和样品的性质而改变，包括改变洗脱液的极性、离子强度、PH值，或改用竞争性抑制剂或变性剂等。这就可使各种物质（即使仅有一个基团的差别或是同分异构体）都能获得有效分离。 分离系统分离系统：该系统包括色谱柱色谱柱(有时会配保护柱)、连接管连接管和恒温器恒温器等。色谱柱一般长度为1050cm（需要两根连用时，可在二者之间加一连接管），内径为25mm，由“优质不锈钢或厚壁玻璃管或钛合金等材料制成，住内装有直径为510m粒度的固定相（由基质和固定液构成）固定相中的基质是由机械强度高的树脂或硅胶构成，它们都有惰性（如硅胶表面的硅酸基因基本已除去）、多孔性（孔径可达1000?）和比表面积大的特点，加之其表面经过机械涂渍（与气相色谱中固定相的制备一样），或者用化学法偶联各种基因（如磷酸基、季胺基、羟甲基、苯基、氨基或各种长度碳链的烷基等）或配体的有机化合物。因此，这类固定相对结构不同的物质有良好的选择性。例如，在多孔性硅胶表面偶联豌豆凝集素（PSA）后，就可以把成纤维细胞中的一种糖蛋白分离出来。检测系统检测系统：紫外检测器、二极管阵列检测器、示差折光检测器、荧光检测器等 此外还要有储液瓶及废液瓶，有的还要配脱气机（四元低压）、混合气（二元高压）。 v本系统由2个LC-10ATvp溶剂输送泵（分主/A泵和副/B泵）、Rheodyne 7725i手动进样阀、SPD-10Avp紫外-可见检测器、SCL-10AVP系统控制器、CLASS-VP（）工作站和IBM台式电脑等组成。实验步骤v1.准备 (1)使用前应根据待检样品的检验方法准备所需的流动相，用合适的滤膜过滤，超声脱气20min。 (2) 根据待检样品的需要更换合适的色谱柱（柱进出口位置应与流动相流向一致）和定量环。 (3) 配制样品和标准溶液（也可在平衡系统时配制），用合适的滤膜过滤。 (4) 检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正常。 2、开机v(1) 接通电源，依次开启不间断电源、B泵、A泵、检测器、系统控制器，待泵和检测器自检结束后，打开电脑显示器、主机。 (2) 启动CLASS-VP工作站 a 确认仪器、系统控制器启动后，打开计算机电源，并从Windows的任务栏中选择Start Programs Chromatography CLASS-VP以打开CLASS-VP菜单窗口。（可以通过桌面上的快捷方式，迅速打开CLASS-VP主菜单） b 在Main Menu 窗口中双击Instrument图标。 c 输入用户名和口令，以登录CLASS-VP。缺省情况下，已经用户名和口令分别为“system”“2001”。d 当SCL-10Avp发出蜂鸣声后，说明已建立与计算机之间的连接，Instrument窗口打开。 e 启动色谱图监视器 从Windows任务栏中选择Program Chromatography Chromatogram Monitor 以打3、设置分析参数 v(1) 设置新的分析参数时，请从通过单击“New”按钮打开的 列表中选择New Method，则将加载缺省方法参数，且方法文件名“”将显示在LC Setup Assistant窗口中，通过单击Open按钮即可打开现有的方法文件。 v(2) 通过在LC Setup Assistant窗口中单击泵和检测器的图标来配置LC参数。使用时钟图标输入时间程序命令。 v(3) 选择 File Method Save as 并输入方法名称。 v(4) 将方法下载到SCL-10Avp：完成创建方法之后，单击下面的Download图标即可将该方法下载到SCL-10Avp上。下载完成时，出现一个消息窗口，请单击OK。 v(5) 启动仪器控制：激活SCL-10Avp，将液体流量调整到已下载的方法参数。当所有组分稳定时，出现“Ready”指示灯，且状态栏变为绿色。 4、平衡色谱系统v(1)用检验方法规定的流动相冲洗系统，一般最少需6倍柱体积的流动相。 v(2)检查各管路连接处是否漏液，如漏液应予以排除。 v(3) 观察泵控制屏幕上的压力值，压力波动应不超过1MPa。如超过则可初步判断为柱前管路仍有气泡，要重新排气泡。 v(4)观察基线变化。如果冲洗至基线漂移，噪声为时，可认为系统已达到平衡状态，可以进样。 进样、采集运行v1 进样 (1) 进样前按检测器zero键调零，按软件中 零点校正 按钮校正基线零点，再按一下 查看基线 按钮使其弹起。 (2)用试样溶液清洗注射器，并排除气泡后抽取适量。 v2采集运行 从菜单栏中选择 Control Show Tray。或者，单击LC Setup Assistant窗口中的“Single Run”按钮或工具栏上的Single Run按钮。指定所需的项并单击Start按钮。 清洗系统和关机v 数据采集完毕后，关闭检测器，继续以工作流动相冲洗10min后，换水冲洗。 1 清洗进样阀 (1) 用启动注射器吸10ml超纯水； (2) 将注射针导入口冲洗头（Rheodyne部件号7125-054）连接到注射器出口上 （不要针），并将它们一起接到进样口上； (3) 使进样阀保持在Inject位置，慢慢将水推入，水将通过注射针导入口、引导管、注射针导入管和注射针密封圈，由样品溢出管排出。 2、 清洗柱 (1) C18柱先用超纯水以1ml/min冲洗40min以上，再用甲醇或乙腈冲洗20min。 (2) Protein PAK60柱先用超纯水冲洗90min以上，再用甲醇或乙腈冲洗40min。 3、 用水冲洗柱后，分别用20ml超纯水冲洗柱塞杆外部和法兰盘上小孔。 4、 清洗完成后，先将流速降到0，再依次关闭泵、脱气机、UPS，断开电源。 5、填写使用记录。实例：中药决明子HPLC色谱图5个标准品样品与标准物质对照图谱