HIV抗体检测技术简介 深圳市疾病预防控制中心艾滋病防治科 王晓辉 2021年4月29日1HIV 1+2抗体检测依据n卫生部?关于颁发全国艾滋病检测工作标准的通知?卫疾控发1998第28号2HIV抗体检测实验室种类和分级1.种类：确证实验室：抗体确证中心、确证实验室 初筛实验室：初筛中心和初筛实验室。n分级：省级HIV抗体确证中心，在市、县区卫生防疫站或有关系统中设立HIV抗体确证、初筛中心和初筛实验室。3 HIV抗体初筛实验室任务n作HIV抗体初筛检测，并提供检测前、后的咨询效劳。n及时将初检阳性的标本送HIV抗体初筛中心实验室，再转送确证实验室确证。n作好初检标本登记、实验记录，每月5日向当地的HIV抗体初筛中心实验室报告HIV抗体检测情况。4 HIV抗体确证实验室任务承担卫生部和省卫生厅指定区域HIV抗体确证任务。承担局部HIV抗体初筛任务。及时向省级HIV抗体确证中心和同级卫生局报告确证的阳性结果。按月向省HIV抗体确证中心报告HIV抗体检测工作情况。5 HIV抗体检测实验室必备条件人员条件：人数、职称、从事血清学检验经历、培训、复训设备条件实验用房或检测操作区间；仪器设备；使用高敏感度和特异度的初筛、确证试剂；要建立血清库6HIV抗体检测实验室的审批和管理n广东省实行HIV抗体检测实验室资格审批制度n从事HIV抗体检测工作人员必须要有上岗合格证n未经审批的实验室和人员不得开展HIV抗体检测工作7HIV抗体检测实验室的审评省卫生厅成立广东省HIV抗体检测初筛实验室资格审评组审评组的职责：对申报HIV抗体检测初筛实验室的单位进行现场考核、技术论证和评价；对HIV抗体检测初筛实验室的工作进行技术指导和考核；为全省HIV抗体检测工作和实验室建立及管理提供咨询和建议审评组的常规组织工作委托广东省HIV抗体检测确证中心负责。8910艾滋病检测方法n一、HIV抗体检测n 1. HIV抗体初筛检测: ELISA法、颗粒凝集法、免疫斑点法、放n 射免疫法n 2. HIV抗体确证检测: 免疫印迹法WB、条带免疫印迹法 n LIA、免疫荧光法IFA、放射免疫沉淀法RIPA。n二、艾滋病的病原学诊断n 1. HIV抗原P24 和逆转录酶RT检测；n 2. 病毒培养;n 3. 基因诊断: 探针杂交、nt-PCR、HIV RNA定量RT-PCR、 n bDNA、NASBA 11HIV抗体初筛检测n一、一、HIV抗体检测要求抗体检测要求:n1. 实验室实验室:HIV抗体检测初筛和确证实验室须分抗体检测初筛和确证实验室须分别经省级卫生行政别经省级卫生行政n 部门和卫生部考核、审评和批准前方可从事部门和卫生部考核、审评和批准前方可从事艾滋病检测工作艾滋病检测工作: n2. 检测场所：符合检测场所：符合?全国艾滋病检测工作标准全国艾滋病检测工作标准?的要求；的要求；n3. 人员人员: 经国家或省级艾滋病抗体检测学习班经国家或省级艾滋病抗体检测学习班培训培训;n4. 试剂试剂: 批批检合格、进口许可证、生物制品批批检合格、进口许可证、生物制品检定所检定、在有效期内的检定所检定、在有效期内的HIV-1/2混合型试混合型试剂；剂；n5. 保密保密: 初筛检测的阳性结果不是最终结果初筛检测的阳性结果不是最终结果,必须经确证试验由必须经确证试验由n HIV抗体确证实验室出具阳性报告才具有法抗体确证实验室出具阳性报告才具有法律效应律效应,且须由卫生且须由卫生n 行政部门选择适当方式和时间通知其本人及行政部门选择适当方式和时间通知其本人及其家属其家属,不得向无关人员透露有关情况不得向无关人员透露有关情况,感染者感染者档案以机密形式专人负责管理档案以机密形式专人负责管理;12n6. 标本运送和保存: 及时别离血清(浆)、无变质、无污染、无溶血。n7. 天气炎热、路途较远时应低温用带盖不易破损容器专人运送，n8.并详细填写送检单；城区24小时、农村48小时内送确证实验室n9.并及时报辖区卫生防疫站。13HIV抗体检测nHIV感染后的感染后的“窗口期窗口期Window period：n 指从指从HIV感染后到用现有方法能检出感染后到用现有方法能检出HIV病原体病原体HIV抗原或核酸和抗原或核酸和/或抗体前的这段时间。或抗体前的这段时间。n血清阳转血清阳转Seroconversion：n 随着感染的过程进展，随着感染的过程进展，HIV抗体浓度或滴度随之抗体浓度或滴度随之增多，血清增多，血清HIV抗体由阴性转为阳性，这个过程称之。抗体由阴性转为阳性，这个过程称之。n 个体差异、检测方法的种类和试剂的敏感性是影个体差异、检测方法的种类和试剂的敏感性是影响响“窗口期长短主要因素。通常情况下，病毒别离培窗口期长短主要因素。通常情况下，病毒别离培养和养和PCR法检测法检测HIV RNA的的“窗口期约为窗口期约为7天左右；天左右；检测检测P24抗原的抗原的“窗口期约为窗口期约为14-21天；检测抗体的天；检测抗体的“窗口期约为窗口期约为31-60天。尽量缩短天。尽量缩短“窗口期，提高窗口期，提高检测方法的灵敏度对于检测方法的灵敏度对于HIV感染的早期诊断，特别是感染的早期诊断，特别是在献血员的筛查，防止病毒传播方面具有重要意义。在献血员的筛查，防止病毒传播方面具有重要意义。目前许多试剂生产商已成功研制开发出能同时检出目前许多试剂生产商已成功研制开发出能同时检出HIV抗原和抗体第四代诊断试剂，并开始进行商业化抗原和抗体第四代诊断试剂，并开始进行商业化生产和推广应用。生产和推广应用。14哪种情况下需要进行哪种情况下需要进行HIV检查检查n1、有高危行为者：如不平安性行为、卖淫嫖娼、吸毒者；n2、不平安受血或血制品使用史者，接受器官移植手术者；n3、HIV感染者/AIDS病人密切接触者及经常接触这类患者的医护人员或实验室工作人员；n4、有以下临床病症或体症者：n1反复而持续性的低热、腹泻；n2不明原因的体重下降；n3浸润性宫颈癌年轻女性；n4中青年出现严重疱疹病毒感染，且治疗效果不佳；n5局部或全身性念珠菌、真菌感染口腔、肠道、呼吸道、中枢神经n 系统、外阴或阴道等、CMV感染等；n6弓形体脑病、隐球菌性脑膜炎、年轻人不明原因失明、失忆、智力n 障碍等；n7严重进展迅速的结核杆菌感染；n8反复发作的肺部炎症、PCP等。n9皮肤癌、卡波氏肉瘤、淋巴瘤、严重毛囊炎等。15常用的HIV抗体初筛检测方法n一、颗粒凝集法一、颗粒凝集法n原理：将可溶性原理：将可溶性HIV抗原吸附或偶联至抗原吸附或偶联至无关载无关载n 体颗粒上，使之成为致敏载体颗粒，体颗粒上，使之成为致敏载体颗粒，与待与待n 检标本中检标本中HIV抗体结合，出现肉眼可抗体结合，出现肉眼可见的凝见的凝n 集现象。集现象。HIV抗原通常为完整病毒裂抗原通常为完整病毒裂解产物、解产物、n 基因重组或合成多肽抗原成分，常用基因重组或合成多肽抗原成分，常用的无关的无关n 载体为载体为RHO型人红细胞和动物绵型人红细胞和动物绵羊、兔、羊、兔、n 鸡鸡 等红细胞、活性炭或硅酸铝颗等红细胞、活性炭或硅酸铝颗粒、聚粒、聚n 丙乙丙乙 烯乳胶颗粒、明胶颗粒等。烯乳胶颗粒、明胶颗粒等。16PA PA 定性试验定性试验C C 对照颗粒对照颗粒S S 致敏颗粒致敏颗粒M M 阴性颗粒阴性颗粒17PA PA 定量试验定量试验C C 对照颗粒对照颗粒S S 致敏颗粒致敏颗粒M M 阴性颗粒阴性颗粒1819颗粒凝集法的特点和适用范围n1. 操作简便，快速，通常在1-2小时时n 间报告结果，适于大规模普查。n2. 整个实验在18-25室温下完成，无n 需洗涤和任何仪器特别适合于基层卫n 生单位、野外或紧急情况的HIV抗体检n 测。n3. 价格低廉。n4. 特异性，敏感性较好。20快速试剂和PA的应用n偏远地区n急诊n临床高危n职业暴露n临产21二、酶联免疫吸附试验Enzyme linked immunosorbent assay,ELISAn简介：n 酶联免疫吸附试验简称酶标法，是根据酶免疫测定原理开展的一种技术，目前已广泛用于各种抗原和抗体的检测，也是最常用的HIV抗体检测方法。近年来随着生物技术的不断开展，众多试剂生产商对检测方法的多个环节从技术上进行改进和完善，目前已推出第四代HIV抗体ELISA检测试剂，但其根本方法分三类：间接法、双抗原夹心法和抗原竞争法。22HIV抗体测定HIV抗体试剂盒进展代次抗原方法检测时间1全病毒间接 2个月2 重组或多肽 间接3-4 周3 重组+多肽夹心4-7 天4抗原+抗体夹心抗原 5pg23HIV抗体测定特点第一代全病毒HIV-1型第二代重组/蛋白/多肽联合HIV-2型敏感度同第一代，特异度提高第三代重组/蛋白/多肽 间接法改为直接法除IgG外能检出早期IgM,缩短窗口期24第四代HIV抗体试剂的特点n抗原抗体联合检测不能取代血液单个抗原的筛查前者抗原检测范围20-100pg/ml，pg/ml，增加假阴性n在急性感染期单一P24测定较第四代试剂检出早1-2天n第四代试剂在HIV-1非B亚型、O型和HIV-2的敏感度差异较大n由于参加检测抗原的抗-24抗体可减少单一第三代HIV抗体试剂的敏感度n可能会增加非特异性反响的危险性第三代假阳性率0.2%增至0.3%-0.8%n在检测程序上凡第四代阳性，要进行抗原的证实试验n核酸测定比抗体提前11天n1998年Bernard Webur首先评估了第四代试剂平均减少4天窗口期25酶联免疫吸附试验影响因素酶联免疫吸附试验影响因素n1. 反响温度：ELISA实验一般在3540度，在一定范围内，提高温度可以n 加快抗原抗体的结合率。n2. 反响时间：在ELISA测定中，抗原或抗体被包被在固相的外表，抗原n 抗体反响只能在固相外表附近进行，远离固相外表的物质要靠浓度差n 的改变缓慢地参与反响，所以在37度条件下需要12小时才能到达反响平衡，在操作时一定要使各步反响到达足够的时间。n3. 样本参加量：加样量太少使敏感性下降和产生误差；加大样本量在一n 定范围内可提高敏感性，但有可能使特异性下降。要注意检查加样器n 的精确度。n4. 酶稳定性：酶结合物在冻干或浓缩状态下可以在较长时间内保持稳定，稀释后滴度下降较快。试剂盒应在有效期内使用。n5. 交叉反响性：加样或分血过程中血样的交叉污染可导致假阳性反响。n6. “灰区反响:将OD值在Cut-Off10%范围内的样本称之。此类样本应该高度重视并进行复检，以便于发现早期感染者。26HIV抗体初筛检测的局限性抗体初筛检测的局限性n1. 阳性反响样本不能确证，需用本法和其它方法复检，如仍为阳性，需确证试剂进一步确证。n2. 阴性结果不能排除HIV感染：HIV感染后血清阳转前n 的“窗口期，HIV抗体检测为阴性，晚期艾滋病患者n 某些抗体如P24等可能检测不到。此外反响中抗n 体量过多，抗原抗体比例不适而不能形成特定的结n 合，而出现凝集抑制。n3. 可能出现假阳性或假阴性结果：了解试剂供给商因n 其使用抗原和包被方法技术存在一定差异。n4.不能诊断6的样本绝大局部为n 阳性。30HIV抗体确证检测抗体确证检测n HIV抗体确证是目前国际上通用的对样品中血清学检测HIV 抗体阳性结果的最终评价。它是应用高特异性试剂来证实和判断HIV抗体初筛阳性反响是由于真的HIV-1和/或HIV-2感染引起，还是由于非特异性交叉反响或与HIV感染无关的其它因素所致。根据国家卫生部规定，HIV抗体阳性报告必须由卫生部认证并取得资格的HIV抗体确证实验室出具才有法律效应。n 常用的HIV抗体确证实验方法有免疫印迹法Western Blot，WB，条带免疫印迹法Strip Immunoblot Assay 或 Linear Immunoblot Assay，SIA 或LIA，免疫荧光法Immunofluorescence Assay，IFA和放射免疫沉淀法Radioimmunopreciptation Assay，RIPA。其中以WB法最常用，而后二种在我国极少使用，在此不作详细介绍。31免疫印迹实验免疫印迹实验WB（原原理理：HIV-1纯纯培培养养物物经经灭灭活活和和裂裂解解处处理理后后在在SDS-PAGE凝凝胶胶上上电电泳泳，不不同同分分子子量量的的HIV-1抗抗原原在在凝凝胶胶中中的的泳泳动动速速率率不不同同而而被被别别离离。通通过过电电转转移移等等方方法法将将凝凝胶胶中中的的抗抗原原转转印印至至硝硝酸酸纤纤维维素素膜膜上上如如为为HIV-1/2混混合合型型试试剂剂还还需需在在硝硝酸酸纤纤维维素素膜膜上上的的适适当当位位置置喷喷涂涂基基因因重重组组或或合合成成的的HIV-2抗抗原原多多肽肽，含含HIV抗抗原原的的条条膜膜与与适适当当比比例例稀稀释释的的待待检检血血清清浆浆样样品品共共同同孵孵育育，如如样样品品中中含含有有HIV-1和和/或或HIV-2特特异异性性抗抗体体那那么么与与条条膜膜 上上一一定定位位置置的的相相应应HIV抗抗原原分分子子结结合合，在在膜膜上上形形成成HIV抗抗原原-HIV抗抗体体复复合合物物。洗洗涤涤除除去去未未结结合合物物质质，参参加加酶酶标标记记抗抗人人免免疫疫球球蛋蛋白白，形形成成HIV-抗抗原原-HIV抗抗体体-酶酶标标记记抗抗人人免免疫疫球球蛋蛋白白复复合合物物，再再次次洗洗涤涤后后参参加加反反响响，在在HIV抗抗体体与与相相应应HIV抗抗原原分分子子结结合合位位置置处处出出现现肉肉眼眼可可见的呈色条带。见的呈色条带。32HIV抗体确证实验结果评价抗体确证实验结果评价1n阳性：至少一条env带(gp41、gp120、gp160)和一条pol带p65、p51,p32。n至少一条env带和一条gag带p55、p24、p18。n至少一条env带和一条gag带和一条pol带。n至少两条env带。n阴性：无上述反响条带n可疑：只有gag带和pol带，无env带n 33HIV抗体确证实验结果评价抗体确证实验结果评价2nHIV抗体不确定或可疑结果的评价：n 在某些情况下，有些初筛阳性或阴性样品的HIV抗体确证实验可出现不典型的HIV抗体反响性条带图谱，既不能确定为阳性也不能确定为阴性，称为HIV抗体不确定Indeterminant或可疑阳性。该现象的出现频率通常取决于所分析的人群类型和/或选择用于免疫印迹实验人群的筛选方法。此时应每3个月追踪随访一次，共2次，如为阴性或仍为不确定结果，那么按阴性结果报告；如出现阳转，那么按阳性结果报告。34HIV抗体确证实验结果评价抗体确证实验结果评价3n可能导致HIV抗体不确定结果出现的原因：nHIV早期感染，此时可能仅出现一条env带，或p24、n p31、p55带；n非特异反响，如在高丙球蛋白血症、某些病毒性疾n 病和寄生虫感染、自身免疫性疾病等情况下可出现n 该现象；n少数晚期艾滋病患者；n与HIV裂解物中的宿主细胞成分发生交叉反响。35HIV抗体确证实验结果评价抗体确证实验结果评价4nHIV-1HIV-1与与HIV-2HIV-2交叉反响和交叉反响和HIV-2HIV-2抗体确证：抗体确证：n1 1、HIV-2HIV-2主主要要在在西西非非国国家家流流行行，但但目目前前已已扩扩散散到到世世界界上上许许多多国国家家，近近年年来来我我国国在在非非洲洲劳劳务务输输出出回回国国人人员员和和旅旅游游者者中中也也发发现现了了少少数数HIV-2HIV-2感感染个案。染个案。n2 2、HIV-2HIV-2抗抗原原主主要要为为envenv基基因因编编码码的的gp140gp140、gp105gp105、gp36gp36，gaggag基基因因编编码码的的p56p56、p26p26、p16p16，polpol基基因因编编码码的的p68p68、p34p34。HIV-2 HIV-2 gaggag和和polpol基基因因与与HIV-1HIV-1的的同同源源性性为为60%60%，envenv基基因因差差异异较较大大，二二者者的的同同源源性性约约为为35-40%35-40%。因因此此，HIV-1HIV-1和和HIV-2HIV-2在血清学上有一定的交叉反响性。在血清学上有一定的交叉反响性。n3 3、目目前前市市售售HIV-1/2HIV-1/2混混合合型型初初筛筛和和确确证证试试剂剂大大局局部部是是将将gp36gp36和和/ /或或gp105gp105重重组组蛋蛋白白或或合合成成多多肽肽与与HIV-1HIV-1抗抗原原一一起起包包被被在在固固相相载载体体或或喷喷涂涂在在印印迹条膜上，可同时检测迹条膜上，可同时检测HIV-1HIV-1和和HIV-2HIV-2型抗体。型抗体。36HIV抗体确证实验结果评价抗体确证实验结果评价5nHIV-1 O亚群的检测：亚群的检测：nHIV-1 O亚亚群群的的基基因因型型和和表表现现型型均均与与HIV-1 A-J亚亚型型简简称称HIV-1 M群群和和HIV-2存存在在较较大大差差异异，因因此此，常常规规的的HIV-1 M群群和和/或或HIV-2试试剂剂和和检检测测方方法法在在筛筛查查HIV-1 O 亚亚群群阳阳性性血血样样时时有有较较高高的的漏漏检检率率，且且用用一一般般的的WB试试剂剂检检测测时时通通常常为为不不确确定定结结果果。目目前前局局部部试试剂剂供供给给商商已已将将基基因因重重组组或或合合成成HIV-1 O亚亚群群特特异异性性抗抗原原混混合合包包被被在在固固相相载载体体上上 HIV-1/2 plus O试试剂剂或或喷喷涂涂在在印印迹迹条条膜膜上上如如Organon公公司司生生产产的的iaTek HIV 试试剂剂盒盒，从从而而可可同同时时检检测测HIV-M群群、亚群和亚群和HIV-2型抗体。型抗体。37