植物医药基因工程研究进程 生物化工生物化工王庆宇王庆宇n n近10年来植物基因工程取得夸人瞩目的成就，如抗虫棉、彩色棉、抗虫玉米、大豆等，都已进入产业化和商品化阶段迄今美国已批准50多例转基因产品商品化，14的耕地种植转基因植物美国市场已有近4000种食品来自遗传工程体，据最保守估计全球生物技术市场近5年内将超过1000亿美元除农业方面的成就外，转基因植物作为生物反应器生产医药产品更是表现出诱人魅力，如转基因烟草生产抗体，转基因土豆生产可食性疫苗等，前景十分广阔本文综述植物医药基因工程研究进展1 植物医药基因工程的发现 n n植物医药基因工程是指把重组的编码药用活性多植物医药基因工程是指把重组的编码药用活性多肽和疫苗基因导人植物，使转基因植物能够大量肽和疫苗基因导人植物，使转基因植物能够大量生产这些活性多肽和疫苗，它是工厂化农业或分生产这些活性多肽和疫苗，它是工厂化农业或分子药田的有诱惑力的部分这种策略不仅可以大子药田的有诱惑力的部分这种策略不仅可以大大降低这些本来昂贵的药品的生产成本，而且简大降低这些本来昂贵的药品的生产成本，而且简化了贮存方式因此，在国际上植物基因工程研化了贮存方式因此，在国际上植物基因工程研究的一个新发展趋势就是利用转基因植物生产药究的一个新发展趋势就是利用转基因植物生产药物这方面的工作最早是物这方面的工作最早是19881988年比利时年比利时PGSPGS公司公司的科研人员做的，本意是想让烟瘾君子们不用抽的科研人员做的，本意是想让烟瘾君子们不用抽烟而只需拿烟叶闻闻或放在嘴里咀嚼就可过烟瘾，烟而只需拿烟叶闻闻或放在嘴里咀嚼就可过烟瘾，以此减少尼古丁对人体的毒害。他们将一种神经以此减少尼古丁对人体的毒害。他们将一种神经肽的编码基因转入烟草，得到的转基因烟草表达肽的编码基因转入烟草，得到的转基因烟草表达出高产量的神经肽出高产量的神经肽 尽管他们的初衷未能实现，因尽管他们的初衷未能实现，因为神经肽是通过血液运输起作用的，它在为神经肽是通过血液运输起作用的，它在n n口腔中会被降解掉，但却意外地找到一条利用转基口腔中会被降解掉，但却意外地找到一条利用转基困植物生产神经肽的途径此后，其他科学家们纷困植物生产神经肽的途径此后，其他科学家们纷纷加人这一领域的竞争并且成果纷呈，纷加人这一领域的竞争并且成果纷呈， 19891989年美年美国斯格里普斯研究所利用转基困烟草高水平地表达国斯格里普斯研究所利用转基困烟草高水平地表达了单克隆抗体，其表达量选叶子总蛋白量的了单克隆抗体，其表达量选叶子总蛋白量的1.31.3 根据计算，如果按照这种表达水平。美国只需将其根据计算，如果按照这种表达水平。美国只需将其烟草土地面积的烟草土地面积的1 1用来种植这种转基因烟草，就用来种植这种转基因烟草，就可以产生出可以产生出270 kg270 kg的抗体，足以提供给的抗体，足以提供给2727万癌症万癌症患者患者1 1年治疗之用此外，美国年治疗之用此外，美国Bio-resoacesBio-resoaces公司公司利用植物基因工程手段生产白细胞介素利用植物基因工程手段生产白细胞介素2 2；荷兰用；荷兰用转基因马铃薯生产人的血清蛋白，韩国用转基因烟转基因马铃薯生产人的血清蛋白，韩国用转基因烟草和番茄生产人的胰岛素我国北京大学蛋白质工草和番茄生产人的胰岛素我国北京大学蛋白质工程与植物基因工程实验室已克隆了对早中期妊娠引程与植物基因工程实验室已克隆了对早中期妊娠引产极为有效的天花粉蛋白的基因，并首次成功地在产极为有效的天花粉蛋白的基因，并首次成功地在转基因烟草中表达了该基因转基因烟草中表达了该基因 2 转基因植物医药生物反应器的优点 n n迄今在世界范围内正在研究开发的医药活性多肽迄今在世界范围内正在研究开发的医药活性多肽和疫苗估计在和疫苗估计在100100种以上多肽药物中有人胰岛种以上多肽药物中有人胰岛素、人生长激素素、人生长激素(HGH)(HGH)、干扰素、白细胞介素、组、干扰素、白细胞介素、组织血纤维蛋白溶酶原激活剂织血纤维蛋白溶酶原激活剂(TPA)(TPA)、免疫球蛋白、免疫球蛋白( (IgIg) )、心钠素、降钙素、红细胞生长素、心钠素、降钙素、红细胞生长素(EPO)(EPO)、尿、尿激酶、超氧化物歧化酶激酶、超氧化物歧化酶(SOD)(SOD)等等疫苗有麻风杆等等疫苗有麻风杆菌疫苗、脑膜炎球苗疫苗、乙型肝炎疫苗、流感菌疫苗、脑膜炎球苗疫苗、乙型肝炎疫苗、流感疫苗和人免疫缺陷病毒疫苗等等疫苗和人免疫缺陷病毒疫苗等等. . 以往，这些疫以往，这些疫苗和活性多肽是从动物和微生物中获得用植物苗和活性多肽是从动物和微生物中获得用植物生产医用活性多肚和疫苗比用动物和微生物生产生产医用活性多肚和疫苗比用动物和微生物生产具有更大的优越性具有更大的优越性 n n2.1 2.1 植物细胞的全能性植物细胞的全能性植物细胞的全能性植物细胞的全能性n n植物的组织、细胞或原生质体在适当条件下均能植物的组织、细胞或原生质体在适当条件下均能培养成一株完整的植物体药物基因转化到植物培养成一株完整的植物体药物基因转化到植物细胞后可培育出药用植物品种，并稳定遗传，通细胞后可培育出药用植物品种，并稳定遗传，通过种植生产药物。过种植生产药物。n n2.2 2.2 植物种植是最经济的蛋白质生产系统植物种植是最经济的蛋白质生产系统植物种植是最经济的蛋白质生产系统植物种植是最经济的蛋白质生产系统n n种植农业所需要的仅是阳光、来自土壤或肥料的种植农业所需要的仅是阳光、来自土壤或肥料的矿物质营养及水所以药用工厂化农业展现出的矿物质营养及水所以药用工厂化农业展现出的最吸人之处是它能廉价生产高价值的、供不应求最吸人之处是它能廉价生产高价值的、供不应求的蛋白。这样的例子是植物已能够生产人血清蛋的蛋白。这样的例子是植物已能够生产人血清蛋白。据计算，用普通方法生产白。据计算，用普通方法生产1g1g抗体的成本为抗体的成本为2000500020005000美元，而用大豆生产美元，而用大豆生产1000g1000g抗体只抗体只需需100100美元美元n n2.3 2.3 植物是能够大规模生产蛋白质的生产系统植物是能够大规模生产蛋白质的生产系统植物是能够大规模生产蛋白质的生产系统植物是能够大规模生产蛋白质的生产系统n n当人们期望相当大规模地生产某种蛋白时，植物当人们期望相当大规模地生产某种蛋白时，植物系统表现出是一个比微生物或动物更理想的生产系统表现出是一个比微生物或动物更理想的生产系统而且，现代化农业机械化能够有效地收割系统而且，现代化农业机械化能够有效地收割和加工大量的植物材料和加工大量的植物材料. .n n2.4 2.4 用植物生产疫苗简单、方便用植物生产疫苗简单、方便用植物生产疫苗简单、方便用植物生产疫苗简单、方便n n用动物或微生物生产口服疫苗需要特殊的专业知用动物或微生物生产口服疫苗需要特殊的专业知识和特殊的贮藏条件识和特殊的贮藏条件( (包括冷藏包括冷藏) )，这对于第三世，这对于第三世界国家是困难的，这些生产系统还存在一些其他界国家是困难的，这些生产系统还存在一些其他的弊端。例如，多数微生物培养系统需要昂贵的的弊端。例如，多数微生物培养系统需要昂贵的生产培养基，而且培养基需要特殊处理，以消除生产培养基，而且培养基需要特殊处理，以消除致病的有害生物，动物系统生产力低，养殖困难，致病的有害生物，动物系统生产力低，养殖困难，繁殖慢，也需要保持无菌生产条件。如果用植物繁殖慢，也需要保持无菌生产条件。如果用植物来生产疫苗，则克服了上述弊端。来生产疫苗，则克服了上述弊端。n n利用植物能够贮藏蛋白质于种子中这一有利条利用植物能够贮藏蛋白质于种子中这一有利条件，可以简单地、方便地生产、贮藏和发放疫件，可以简单地、方便地生产、贮藏和发放疫苗同样，使疫苗能够在水果和蔬菜中表达也是苗同样，使疫苗能够在水果和蔬菜中表达也是目前研究的一个重要方向目前研究的一个重要方向n n2.5 2.5 植物具有完整的真核细胞表达系统植物具有完整的真核细胞表达系统植物具有完整的真核细胞表达系统植物具有完整的真核细胞表达系统n n表达产物可糖基化、酰胺化、磷酸化，亚基可以表达产物可糖基化、酰胺化、磷酸化，亚基可以正确装配等转译后加工过程，使表达产物具有与正确装配等转译后加工过程，使表达产物具有与高等动物细胞一致的免疫原性和生物活性。高等动物细胞一致的免疫原性和生物活性。n n2.6 2.6 表达产物安全可靠表达产物安全可靠表达产物安全可靠表达产物安全可靠n n表达产物无毒性和副作用，无残存表达产物无毒性和副作用，无残存DNADNA和潜在致和潜在致病、致癌性。病、致癌性。n n由于植物所具有的上述优势，所以分子药田农业由于植物所具有的上述优势，所以分子药田农业的设想在的设想在8080年代末一经提出，便成为人们竞相研年代末一经提出，便成为人们竞相研究的热点目前，科学家们在此领域已取得一定究的热点目前，科学家们在此领域已取得一定成绩，这主要表现在成绩，这主要表现在3 3方面：一是成功地用植物生方面：一是成功地用植物生产药用蛋白；二是成功地在植物中表达抗体；三产药用蛋白；二是成功地在植物中表达抗体；三是成功地用植物生产某些动物疫苗是成功地用植物生产某些动物疫苗3 植物基因工程生产药用蛋白n n3.1 3.1 研究进展研究进展 n n从从9090年代初开始植物医药基因工程的研究以来已年代初开始植物医药基因工程的研究以来已经取得了可喜的进展，表现出诱人的魅力，迄今经取得了可喜的进展，表现出诱人的魅力，迄今已获得的具有潜在产业化价值的转基因植物表达已获得的具有潜在产业化价值的转基因植物表达药物重组蛋白列附表药物重组蛋白列附表 。重组蛋白重组蛋白名称名称相对分相对分子质量子质量基因基因来源来源植物植物名称名称表达水平表达水平单克隆抗体单克隆抗体键球菌键球菌烟草烟草叶子可溶性蛋白叶子可溶性蛋白0. 30. 3单链单链FvFv表位表位5.05.0肿瘤细肿瘤细胞胞烟草烟草种子可溶性蛋白种子可溶性蛋白1. 0 g1. 0 g凝乳酶凝乳酶30.0 30.0 小牛小牛烟草烟草可溶性蛋白可溶性蛋白 0.10.1 0.50.5右旋糖昔转移酶右旋糖昔转移酶36.036.0疮疹病疮疹病毒毒马铃薯马铃薯茎块可溶性蛋白茎块可溶性蛋白0.10.1脑啡肽脑啡肽0.50.5人人苜蓿苜蓿种子可溶性蛋白种子可溶性蛋白0.10.1促红细胞生成素促红细胞生成素37.537.5人人烟草烟草可溶性蛋白可溶性蛋白0.002 60.002 6生长激素生长激素21.021.0鳟鱼鳟鱼烟草烟草叶子可溶性蛋白叶子可溶性蛋白0.10.1HL-BHL-B39.039.0大肠杆大肠杆菌菌烟草烟草叶子可溶性蛋白叶子可溶性蛋白0. 0010. 001重组蛋白重组蛋白名称名称相对分相对分子质量子质量基因基因来源来源植物植物名称名称表达水平表达水平乙肝表面抗原乙肝表面抗原24.024.0乙肝病乙肝病毒毒烟草烟草叶子可溶性蛋白叶子可溶性蛋白0. 0070. 007 HirudinHirudin11.011.0苜蓿苜蓿种子重量种子重量 1 1r r链和链和 k k链链 4545，2727 鼠鼠烟草烟草叶子可溶性蛋白叶子可溶性蛋白 1. 31. 3 - -干扰素干扰素20.020.0人人烟草烟草净重净重 0.0000170.000017溶菌酶溶菌酶14.414.4鸡鸡烟草烟草叶子净重叶子净重 0.0030.003疟疾表位疟疾表位0.60.6疟原虫疟原虫烟草烟草病毒重病毒重 0.40.40.8 0.8 肌醇六磷酸酶肌醇六磷酸酶80.080.0烟草烟草叶子可溶性蛋白叶子可溶性蛋白 14 .414 .4 蓖麻蛋白蓖麻蛋白34.034.0烟草烟草叶子可溶性蛋白叶子可溶性蛋白 0.250.25 重组蛋白重组蛋白名称名称相对分子相对分子质量质量基因基因来源来源植物植物名称名称表达水平表达水平血清白蛋白血清白蛋白66.566.5人人马铃薯马铃薯叶子可溶性蛋白叶子可溶性蛋白0.020.02木聚糖酶木聚糖酶37.037.0烟草烟草叶子可溶性蛋白叶子可溶性蛋白4.14.1血管紧素血管紧素牛奶牛奶烟草烟草表生长因子表生长因子人人烟草烟草水蛭素水蛭素人工合人工合成成油菜油菜人乳铁蛋白人乳铁蛋白人人烟草烟草从附表中可见，各种蛋白质表达累积量差别很大，从附表中可见，各种蛋白质表达累积量差别很大，如重组肌醇六磷酸可表达在烟草叶细胞外的部分，如重组肌醇六磷酸可表达在烟草叶细胞外的部分，累积量可达可溶性蛋白的累积量可达可溶性蛋白的 1414。n n因此，植物生产药用蛋白质或酶类具有极大的商业价值。因此，植物生产药用蛋白质或酶类具有极大的商业价值。但是，该研究领域还处于开始阶段，技术等尚未完全成熟，但是，该研究领域还处于开始阶段，技术等尚未完全成熟，本文结合近年来的有关研究，对植物生产药用蛋白系统整本文结合近年来的有关研究，对植物生产药用蛋白系统整个过程所涉及的同题进行了讨论个过程所涉及的同题进行了讨论 。n n3.2 3.2 植物基因工程生产药用蛋白的程序植物基因工程生产药用蛋白的程序 植物基因工程生产药用蛋白一般包括目的基因的植物基因工程生产药用蛋白一般包括目的基因的克隆、高效表达载体的构建、植物细胞的遗传转克隆、高效表达载体的构建、植物细胞的遗传转化、受体细胞的组织培养和植株再生、转化植株化、受体细胞的组织培养和植株再生、转化植株栽培栽培 、目标产品的分离纯化及纯度鉴定等、目标产品的分离纯化及纯度鉴定等 ，其，其中高效表达载体的构建十分关键，目前急需时空中高效表达载体的构建十分关键，目前急需时空特异性表达的高效启动子和能够稳定遗传的载体特异性表达的高效启动子和能够稳定遗传的载体系统，以解决目前存在的表达水平低和遗传稳定系统，以解决目前存在的表达水平低和遗传稳定性差的问题性差的问题 目前广泛使用的启动子是目前广泛使用的启动子是 CaMVCaMV的的 35S35S启动子，载体系统主要有根癌农杆菌介导的启动子，载体系统主要有根癌农杆菌介导的n n遗传转化系统和以病毒为载体的表达系统，前一遗传转化系统和以病毒为载体的表达系统，前一系统主要转化双子叶植物，能够稳定遗传，但产系统主要转化双子叶植物，能够稳定遗传，但产量低。给转基因植物生产药用蛋白提出一个重要量低。给转基因植物生产药用蛋白提出一个重要方向是将目的基因插入病毒基因组中，然后将重方向是将目的基因插入病毒基因组中，然后将重组病毒接种到植物叶片上，任其蔓延至所有叶片，组病毒接种到植物叶片上，任其蔓延至所有叶片，外源基因则随病毒的复制而高水平表达，这样植外源基因则随病毒的复制而高水平表达，这样植物即成为生产该目标蛋白的物即成为生产该目标蛋白的“ “绿色工厂绿色工厂” ”，利用，利用这类方法有望生产较廉价的药用蛋白，近几年来这类方法有望生产较廉价的药用蛋白，近几年来一些实验室已在进行此类研究一些实验室已在进行此类研究 ，美国科学家在，美国科学家在 TMVTMV中插入指导合成血红蛋白和其他蛋白的基因，中插入指导合成血红蛋白和其他蛋白的基因，使用叶片切刀和眼药滴管把重组使用叶片切刀和眼药滴管把重组TMVTMV引入烟草叶引入烟草叶片，片，2 2周之内所有叶片即感染病毒，开始制造周之内所有叶片即感染病毒，开始制造 目目标蛋白这一技术开辟了新的领域，极有希望成标蛋白这一技术开辟了新的领域，极有希望成为药用蛋白的主要来源和生产方法当然，此为药用蛋白的主要来源和生产方法当然，此n n技术要拓宽其应用范围还应解决至少以下技术要拓宽其应用范围还应解决至少以下3 3个方面个方面的问题：的问题：(1)(1)弱病毒株系的选择，要保证该病毒对弱病毒株系的选择，要保证该病毒对植物的侵染不会使宿主植物生长异常，保证外源植物的侵染不会使宿主植物生长异常，保证外源基因的插人不会使病毒失去侵染和复制能力基因的插人不会使病毒失去侵染和复制能力(2)(2)外源蛋白的纯化用最简单的方法获取高纯度高外源蛋白的纯化用最简单的方法获取高纯度高活性的目标蛋白，以适于工业化生产活性的目标蛋白，以适于工业化生产 (3)(3)商业商业化生产还需解决农作物收获的季节性问题，降低化生产还需解决农作物收获的季节性问题，降低收获、运输、贮存过程中的能源消耗和劳动力投收获、运输、贮存过程中的能源消耗和劳动力投入入 4 植物基因工程生产人抗体n n随着随着PGSPGS公司从烟草中表达神经肽的发现后，抗公司从烟草中表达神经肽的发现后，抗体基因在转基因植物中有效表达的研究日益多体基因在转基因植物中有效表达的研究日益多出现了出现了“ “植物抗体植物抗体” ” 这一新名词它是指人或动这一新名词它是指人或动物抗体基因或基因片段在转基因植物中表达的免物抗体基因或基因片段在转基因植物中表达的免疫性产物目前这一领域的研究十分活跃，许多疫性产物目前这一领域的研究十分活跃，许多实验室已成功地利用植物表达系统产生出各种各实验室已成功地利用植物表达系统产生出各种各样的抗体，并试图把抗植物病毒、真菌和细菌的样的抗体，并试图把抗植物病毒、真菌和细菌的抗体基因转人植物中表达，不仅可以获得抗病植抗体基因转人植物中表达，不仅可以获得抗病植物，而且可利用转基因植物生产抗体中科院微物，而且可利用转基因植物生产抗体中科院微生物所也已经克麈了抗生物所也已经克麈了抗RSVRSV外壳蛋白的单链抗体外壳蛋白的单链抗体基因现在正试囝转化到植物中去基因现在正试囝转化到植物中去n n4 41 1 抗体的含义和结构功能抗体的含义和结构功能 抗体的化学本质是球蛋白但并非所有血清球蛋白都抗体的化学本质是球蛋白但并非所有血清球蛋白都是抗体血清球蛋白包括是抗体血清球蛋白包括 球蛋白、吨球蛋白、球蛋白、吨球蛋白、0 0球蛋白和球蛋白和球蛋白，其中具有抗体活性球蛋白，其中具有抗体活性 的蛋白质太部分为的蛋白质太部分为 球蛋白部分球蛋白部分为口球蛋白，少数为为口球蛋白，少数为 a1a1球蛋白球蛋白(Atassi(Atassi等，等，1988)1988)只有这只有这些与抗原特异性结合的球蛋白才可称为抗体些与抗原特异性结合的球蛋白才可称为抗体19641964年世界年世界卫生组织卫生组织(WHO)(WHO)将血清球蛋白的抗体部分命名为免疫球蛋将血清球蛋白的抗体部分命名为免疫球蛋白白(immounogl obulin(immounogl obulin，简称，简称 Ig)Ig)在血清中有在血清中有 5 5类抗体类抗体(IgG(IgG，IgA IgA ，IgMIgM，IgDIgD，IgE)IgE)，每一类均由重链，每一类均由重链(H(H链链) )和和轻链轻链(L(L链链) )组成每个组成每个 L L链和链和 H H链均由一个可变区链均由一个可变区(v)(v)和一个和一个不变区不变区(c)(c)组成不同类的组成不同类的 H H链不变区各不相同，但链不变区各不相同，但 L L链均链均相同抗原结合部位是由相同抗原结合部位是由 L L链和链和 H H链两者的可变区的超变片链两者的可变区的超变片段的残基构成的段的残基构成的 n n免疫球蛋白免疫球蛋白G(IgG)G(IgG)是血清中的主要抗体免疫球是血清中的主要抗体免疫球蛋白蛋白GG的亚基结构是的亚基结构是L2H2.150 KDL2H2.150 KD的的IgGIgG能被木能被木瓜蛋白酶水解为瓜蛋白酶水解为2 2个个 50 KD50 KD的活性片段的活性片段 Fab.Fab.其其 中中FabFab片段能与抗原结合，故被称作片段能与抗原结合，故被称作 FabFab，另一，另一个片段称为个片段称为 FcFc，它不与抗原结合，却介导效应物，它不与抗原结合，却介导效应物功能，如补体的结合等功能，如补体的结合等 利用基因工程技术可以利用基因工程技术可以得到不同的活性抗体片段得到不同的活性抗体片段 除了除了 FabFab和和 FcFc外外还有还有 FVFV，SeFvSeFv和和 dAbdAb，FvFv是由是由2 2条独立的多肽条独立的多肽(VL(VL和和 VH)VH)组装而成，它具有一个完组装而成，它具有一个完 整的抗原结整的抗原结合位点，但它不是特别稳定，合位点，但它不是特别稳定，ScFrScFr。即单链。即单链 Fr(Single-chainFv)Fr(Single-chainFv)是单基因合成的产物，它是单基因合成的产物，它 由由条肽链把条肽链把 VHVH和和VLVL连接在一起，所以是个更稳连接在一起，所以是个更稳定的片段。在设计新的诊断和亲合试剂时，定的片段。在设计新的诊断和亲合试剂时，ScFvScFv是增加活性的焦点。是增加活性的焦点。DabDab属单结构抗体属单结构抗体(Single (Single domain antibody)domain antibody) n n4.2 4.2 完整抗体在植物中的表达完整抗体在植物中的表达n n4.2.1 4.2.1 抗体在转基因烟草中表达抗体在转基因烟草中表达n n 在过去的几年里，国际上有几个研究小组已经在过去的几年里，国际上有几个研究小组已经开始研究完整的抗体分子在植物中的表达。其中，开始研究完整的抗体分子在植物中的表达。其中，HiauHiau等首先报道了在植物中表达重组抗体等首先报道了在植物中表达重组抗体6D46D4的的研究情况研究情况 6D46D4属于属于I I ，它具有结合一种合成磷酸，它具有结合一种合成磷酸酯一酯一P3P3的功能和催化某些羧酸酯水解的作用的功能和催化某些羧酸酯水解的作用 。他。他采用两步的策略表达免疫球蛋白。第一步，他们采用两步的策略表达免疫球蛋白。第一步，他们用用 CaMV35SCaMV35S启动子调控下的编码重链和其信号启动子调控下的编码重链和其信号序列的基因或编码序列的基因或编码 K K轻链和其信号序列的基因分轻链和其信号序列的基因分别转化烟草，分别获得表达重链或轻链的转基因别转化烟草，分别获得表达重链或轻链的转基因植株除此之外，他们还用切除了信号序列的编植株除此之外，他们还用切除了信号序列的编码重链或轻链的基因转化烟草。码重链或轻链的基因转化烟草。n n第二步，他们把表达重链的转基因植株和表达轻第二步，他们把表达重链的转基因植株和表达轻链的转基因植株杂交，获得表达完整抗体链的转基因植株杂交，获得表达完整抗体6D46D4的的植株，对第一步获得的转基因植株进行分析，发植株，对第一步获得的转基因植株进行分析，发现只有表达未经修饰的编码全长的重链或轻链的现只有表达未经修饰的编码全长的重链或轻链的基因的转基因植株中有免疫球蛋白的积累；相反，基因的转基因植株中有免疫球蛋白的积累；相反，虽然在表达编码切除信号序列的重链或轻链的基虽然在表达编码切除信号序列的重链或轻链的基因的转化植株中可以检测到一定水平的转录体，因的转化植株中可以检测到一定水平的转录体，但是这些植株明显地不累积免疫球蛋白。这一结但是这些植株明显地不累积免疫球蛋白。这一结果表明，免疫球蛋白的信号序列对于蛋白质的累果表明，免疫球蛋白的信号序列对于蛋白质的累积是必要的。第二步获得的既表达轻链又表达重积是必要的。第二步获得的既表达轻链又表达重链基因的链基因的F1F1代转基因植株能够产生装配好的完整代转基因植株能够产生装配好的完整抗体，其表达量高达植株总蛋白的抗体，其表达量高达植株总蛋白的 1 1，而且这，而且这种抗体和杂交瘤种抗体和杂交瘤(Hybridoma)(Hybridoma)来源的抗体对于来源的抗体对于P3P3的亲合性是一样的另外他们还发现，的亲合性是一样的另外他们还发现，F1F1代转基因代转基因植株中的免疫球蛋白的表达水平高于其亲本表达植株中的免疫球蛋白的表达水平高于其亲本表达单链的水平，这表明两条链的共表达提高了单链的水平，这表明两条链的共表达提高了n n单链表达的水平，而且链的装配提高了其稳定性，单链表达的水平，而且链的装配提高了其稳定性，在在F1F1代中的表达修饰过的免疫球蛋白的基因的转基代中的表达修饰过的免疫球蛋白的基因的转基因植株中也未能检测到装配的抗体，内质网因植株中也未能检测到装配的抗体，内质网(ER)(ER)对对于链的装配及稳定是必需的。在产生抗体的于链的装配及稳定是必需的。在产生抗体的 B B细胞细胞中，重链和轻链的复合体的装配是在中，重链和轻链的复合体的装配是在 ERER中进行的，中进行的，有两种蛋白参与了这个过程，一是催化形成二硫键有两种蛋白参与了这个过程，一是催化形成二硫键和二硫化合物异构酶和二硫化合物异构酶(Disulphide(Disulphide Isomerase)Isomerase)，另一，另一是结构类似于是结构类似于hsp70hsp70的重链结合蛋白的重链结合蛋白(BiP)(BiP)植物细植物细胞的胞的 ERER腔中具有二硫化物异构酶和腔中具有二硫化物异构酶和 BiPBiP的相应物的相应物而细胞质中却不具备因此修饰基因产生的肽链而细胞质中却不具备因此修饰基因产生的肽链 由于不具备信号序列由于不具备信号序列 ，所以不能定位到，所以不能定位到 ERER从从而不能装配，稳定性也很差。而不能装配，稳定性也很差。n n4.2.2 4.2.2 抗体在转基因拟南芥菜中表达抗体在转基因拟南芥菜中表达n n最近最近 De NeveDe Neve等等(1993)(1993)报道了抗体报道了抗体(IgGI)(IgGI)及其及其FabFab片段在拟南芥菜和烟草中的表达，尽管片段在拟南芥菜和烟草中的表达，尽管 2 2种植种植物表达出的抗体和物表达出的抗体和 FabFab都具有抗原结合能力，但都具有抗原结合能力，但它们的表达量有明显不同。它们的表达量有明显不同。FabFab在烟草中的表达量在烟草中的表达量为叶片总蛋白量的为叶片总蛋白量的0.040.04，而在拟南芥菜中的表，而在拟南芥菜中的表达量则为达量则为 1.31.3。另外，免疫印迹实验表明，在转。另外，免疫印迹实验表明，在转完整抗体基因的拟南芥菜中，含有完整抗体基因的拟南芥菜中，含有 150 KD150 KD的完的完整抗体，而烟草则含有丰富的整抗体，而烟草则含有丰富的50KD50KD抗体片段，这抗体片段，这说明说明 2 2种宿主组装抗体的形式也有差异目前对这些种宿主组装抗体的形式也有差异目前对这些现象的产生机制还不清楚，可能与植物本身的特性现象的产生机制还不清楚，可能与植物本身的特性有关有关 n n4.2.3 4.2.3 抗体基因在植物愈伤组织细胞抗体基因在植物愈伤组织细胞 中的表达中的表达 n n愈伤组织细胞作为去分化细胞也能够有效表达抗体及其功愈伤组织细胞作为去分化细胞也能够有效表达抗体及其功能片段能片段(Hein(Hein等，等，19911991；OwenOwen等，等，1993) 1993) 为了研究抗体为了研究抗体分子在植物细胞内表达后的命运分子在植物细胞内表达后的命运 ，HeinHein等在禽伤组织细等在禽伤组织细胞培养中掺人同位素胞培养中掺人同位素 S S。结果表明，大部分抗体分子在合。结果表明，大部分抗体分子在合成之后，通过细胞膜和细胞壁而被分泌到培养基中，其浓成之后，通过细胞膜和细胞壁而被分泌到培养基中，其浓度可达度可达 20 mg20 mgL L。 n n4.2.4 4.2.4 抗植物病毒单链抗体在转基因植物中的抗病作用抗植物病毒单链抗体在转基因植物中的抗病作用n n最近，意大利学者最近，意大利学者(Tavladorakl(Tavladorakl等，等，1994)1994)把抗菊芋斑皱把抗菊芋斑皱病毒病毒(antichoke mottled crinkle vrius(antichoke mottled crinkle vrius，简称，简称 AMCV)AMCV)的单链抗体基因转入植物体内，使转基因植物不仅表达了的单链抗体基因转入植物体内，使转基因植物不仅表达了抗体蛋白而且还获得了对植物病毒抗体蛋白而且还获得了对植物病毒 AMCVAMCV的抗性，这一结的抗性，这一结果说明动物免疫系统中的抗体同样能够在转基因植物细胞果说明动物免疫系统中的抗体同样能够在转基因植物细胞内发挥中和病毒的作用内发挥中和病毒的作用 ，在植物基因工程细胞内免疫作，在植物基因工程细胞内免疫作用的成功范倒为生产新的抗病植物带来了希望，同时基因用的成功范倒为生产新的抗病植物带来了希望，同时基因工程抗体还将作为一种有利工具用于研究病毒与植物的相工程抗体还将作为一种有利工具用于研究病毒与植物的相互关系互关系 n n4.3 4.3 抗体片断在植物中的表达抗体片断在植物中的表达 n n科研人员的研究结果表明，转基因烟草植株在其科研人员的研究结果表明，转基因烟草植株在其细胞中能产生具有功能的抗体片段细胞中能产生具有功能的抗体片段.Benvenuto.Benvenuto等等把编码一种鼠把编码一种鼠IgGIgG的的VHVH结构域和结构域和 ErwiniaErwinia的果胶的果胶裂解酶前导序列的融合基因导人烟草。获得的转裂解酶前导序列的融合基因导人烟草。获得的转基因植株表达基因植株表达 VHVH结构域多肽，其表达量高达可结构域多肽，其表达量高达可溶性蛋白的溶性蛋白的 1 1。该抗体片段主要在植株的细胞。该抗体片段主要在植株的细胞内累积。内累积。n n4.4 4.4 存在的问题最研究方向存在的问题最研究方向 n n(1)(1)尽管许多研究结果已经证明抗体及其片段能够尽管许多研究结果已经证明抗体及其片段能够在植物中进行有效表达，然而其表达水平尚不尽在植物中进行有效表达，然而其表达水平尚不尽人意。这要通过基因工程手段，对植物表达系统人意。这要通过基因工程手段，对植物表达系统加以改造，可使其能够高效表达符台临床需要的加以改造，可使其能够高效表达符台临床需要的抗体。抗体。 n n (2)(2)有资料表明，中和病毒的外壳蛋白需要过量有资料表明，中和病毒的外壳蛋白需要过量的抗体的抗体 SaunalSaunal等等(1993)(1993)在体外研究中发现，单在体外研究中发现，单克隆抗体与烟草花叶病毒外壳蛋白按克隆抗体与烟草花叶病毒外壳蛋白按 5050：1 1的摩的摩尔浓度孵育尔浓度孵育 18 h18 h，才出现抗体对，才出现抗体对TMVTMV的抑制作的抑制作用。由此可见通过抗体直接中和病原物用。由此可见通过抗体直接中和病原物 而达到植而达到植物抗病的目的显然是困难的。因此，抗体在植物物抗病的目的显然是困难的。因此，抗体在植物抗病方面的应用可能将通过另一种较为理想的途抗病方面的应用可能将通过另一种较为理想的途径，即利用抗病原微生物中非结构蛋白的抗体转径，即利用抗病原微生物中非结构蛋白的抗体转化植物。例如，在植物中表达能中和与病毒复制化植物。例如，在植物中表达能中和与病毒复制或组装有关的酶的抗体或组装有关的酶的抗体 后者不需要很高的浓度就后者不需要很高的浓度就可能有效地干扰病毒的复制。可能有效地干扰病毒的复制。 n n(3)(3)由于动植物遗传背景的差异可能会造成抗体成由于动植物遗传背景的差异可能会造成抗体成分的不同。例如植物抗体重链教基末端碳水化台分的不同。例如植物抗体重链教基末端碳水化台物残基与哺乳动物不同。因此尚需评价植物来源物残基与哺乳动物不同。因此尚需评价植物来源的抗体对人体的免疫原性问题的抗体对人体的免疫原性问题 n n(4)(4)抗体作为植物抗病抗体作为植物抗病 因子是否能在适宜的时间因子是否能在适宜的时间和部位进行适量的表达和部位进行适量的表达 n n(5)(5)抗体是动物体液免疫系统中的防御分子，其功抗体是动物体液免疫系统中的防御分子，其功能是通过免疫系统中补体及细胞因子协同作用完能是通过免疫系统中补体及细胞因子协同作用完成的成的 而植物的防御系统缺乏这些物质而植物的防御系统缺乏这些物质 因此即使因此即使抗体能中和致病因子，如果不能进一步消化和清抗体能中和致病因子，如果不能进一步消化和清除，这些免疫复台物在植物体内除，这些免疫复台物在植物体内 积累是否引起植积累是否引起植物体内的过敏反应妨碍植物的防御功能物体内的过敏反应妨碍植物的防御功能 和正常和正常代谢代谢 n n(6)(6)由于抗体的特异性比较单一即一种抗体只能由于抗体的特异性比较单一即一种抗体只能中和一种或一类结构相似的病原微生物，而大田中和一种或一类结构相似的病原微生物，而大田中分布的病原中分布的病原 体是多样和高频率变异的，因此抗体是多样和高频率变异的，因此抗体作为植物抗病策略在体作为植物抗病策略在 实际应用中还存在许多有实际应用中还存在许多有待解决的问题待解决的问题 5 植物基目工程生产疫苗 n n 近近1010年来，随着基因工程技术的进步，疫苗研究年来，随着基因工程技术的进步，疫苗研究领域异常活跃，基凼工程单克隆疫苗、活载体疫领域异常活跃，基凼工程单克隆疫苗、活载体疫苗、核酸疫苗等各展风姿，让人应接不暇转基苗、核酸疫苗等各展风姿，让人应接不暇转基困植物疫苗也悄然而起，并以其独具的特也困植物疫苗也悄然而起，并以其独具的特也 可食可食( (饲饲) )性，展现了诱人的潜在开发价值性，展现了诱人的潜在开发价值n n 利用转基周植物生产基围工程疫苗是当前的利用转基周植物生产基围工程疫苗是当前的一大热点，也是人们十分关心的问题一大热点，也是人们十分关心的问题. .5.1 5.1 植物基因工程生产人可食性疫苗植物基因工程生产人可食性疫苗n n迄今对不耐热的肠毒素迄今对不耐热的肠毒素 B(LT-B)B(LT-B)转基因植物的研究相对较转基因植物的研究相对较多，效果也较好多，效果也较好 据据 HagHag等报告，用等报告，用 LT-BLT-B基因转化的烟草基因转化的烟草和土豆，其外源基因均能获得表达，井有较好的免疫原性，和土豆，其外源基因均能获得表达，井有较好的免疫原性，在他们的试验中最大表达量，烟草为每在他们的试验中最大表达量，烟草为每 g g可溶性蛋白可溶性蛋白5g5g，土豆块茎为每，土豆块茎为每 g g可藩性蛋白可藩性蛋白30g 30g 。用烟草叶浸提物口。用烟草叶浸提物口服免疫的小鼠服免疫的小鼠( (在在 0.40.4、2121、25d25d灌服。每次约含药量灌服。每次约含药量 12.512.5gg重组重组 LT-BLT-B蛋白蛋白) )，在免疫后，在免疫后 303032 d32 d时采集血清时采集血清和粪便，检测血清和粪便，检测血清lgGlgG和粘膜和粘膜lgAlgA抗体价与有同剂量细菌性抗体价与有同剂量细菌性LT-BLT-B灌服的免疫小鼠完全一致。在同样时间直接饲喂转基灌服的免疫小鼠完全一致。在同样时间直接饲喂转基因土豆因土豆( (每次每次5g5g含含15152020ggLT-B)LT-B)，也都产生血清，也都产生血清lgGlgG和粘和粘膜膜IgAIgA，但与每次灌服，但与每次灌服2020gg细菌性细菌性 LT-BLT-B小鼠相比，抗体浓小鼠相比，抗体浓度较低，笔者认为这一现象是由于生饲土豆中有限制或干度较低，笔者认为这一现象是由于生饲土豆中有限制或干扰重组蛋白与肠粘膜淋巴组织反应的因素存在，但据扰重组蛋白与肠粘膜淋巴组织反应的因素存在，但据 MasonMason等报告，等报告， 每周饲喂小鼠每周饲喂小鼠 1 1次次 ，每次，每次5g5g土豆土豆( (约含约含2020或或 50 g rLT-B),50 g rLT-B),第第 3 3次饲喂后次饲喂后1 1周，血清周，血清IgGIgG和粘膜和粘膜lgAlgA抗抗体水平高于灌服体水平高于灌服5 5gg细菌性细菌性LT-BLT-B的小鼠。而且口服的小鼠。而且口服 2525gg LTLT进行攻击试验时，饲喂试验组虽没有进行攻击试验时，饲喂试验组虽没有1 1只小鼠被完全保只小鼠被完全保护，但免疫保护效果也优于灌服护，但免疫保护效果也优于灌服5 5gg细菌性细菌性LT-BLT-B的对照组。的对照组。 . .n nTaekefTaekef等在自愿者人体进行了生食等在自愿者人体进行了生食 LT-BLT-B转基因土豆免疫转基因土豆免疫试验。参试试验。参试 1414人，分低、高剂量组人，分低、高剂量组 。分别于。分别于 OO、7 7，21 21 d d食用食用 3 3次，每次低剂量组食用次，每次低剂量组食用50g50g转基因土豆，高剂量转基因土豆，高剂量组为组为100g(100g(每克土豆含每克土豆含 3.715.7g rLT-B)3.715.7g rLT-B)，结果表明，结果表明食用食用 7 d7 d后在血循环和类便中即可部分检出后在血循环和类便中即可部分检出IgGIgG和和IgAIgA特特异性抗体，并证明有中和活性。血清异性抗体，并证明有中和活性。血清IgGIgG持续时间较长，持续时间较长，食后食后59 d59 d时，有的个体仍在上升，血清时，有的个体仍在上升，血清 lgAlgA在食后在食后 28 d28 d达高峰；而粪便达高峰；而粪便IgGIgG在在 7 714 d14 d达高峰。粘膜抗体检出率达高峰。粘膜抗体检出率也比血清抗体低，粪便也比血清抗体低，粪便 I I异异A A柱出率为柱出率为 5050，血清，血清 IgGIgG为为 9191，lgAlgA为为 5555。由此可见，对食用转基因。由此可见，对食用转基因LT-BLT-B疫苗疫苗的反应，个体间存在显著差异此外，还初步发现增加食用的反应，个体间存在显著差异此外，还初步发现增加食用土豆剂量土豆剂量 2 2 3 3倍倍 ， AntzenAntzen等在转基因烟草表达等在转基因烟草表达 HbsAgHbsAg疫苗的基础上，现在用莴苣和香蕉做试验，准备制疫苗的基础上，现在用莴苣和香蕉做试验，准备制造造“ “乙型肝类疫苗色拉乙型肝类疫苗色拉” ”和和“ “可食香蕉乙型肝炎疫苗可食香蕉乙型肝炎疫苗” ”，并预期在并预期在 2 2年内达到临床试验阶段。并没有相应的增强免年内达到临床试验阶段。并没有相应的增强免疫反应的作用疫反应的作用 。n n 5.2 5.2 植物基因工程生产动物可食性疫苗植物基因工程生产动物可食性疫苗 n n在动物疫苗的研究同样取得可喜在动物疫苗的研究同样取得可喜 的成果，的成果，CarrilloCarrillo等等 (1998)(1998)用口蹄疫病毒用口蹄疫病毒 VPIVPI基因也获得基因也获得了转基因芥菜，用含有了转基因芥菜，用含有 rVPIrVPI的时浸提物免疫小鼠，的时浸提物免疫小鼠，可诱导产生特异性抗体这种抗体不仅能与可诱导产生特异性抗体这种抗体不仅能与 VPIVPI发发生反应，而且也能与完整的口蹄疫病毒颗粒反应生反应，而且也能与完整的口蹄疫病毒颗粒反应特别令人鼓舞的是，所有免疫小鼠都抵抗了口蹄特别令人鼓舞的是，所有免疫小鼠都抵抗了口蹄疫病毒强毒的攻击。到目前为止，这是关于转基疫病毒强毒的攻击。到目前为止，这是关于转基因植物表达的病毒抗原使免疫动物全部获得保护因植物表达的病毒抗原使免疫动物全部获得保护的首篇报告，遗憾的是也未进行口服免疫试验。的首篇报告，遗憾的是也未进行口服免疫试验。 n n 5.3 5.3 植物基因工程生产疫苗的问题和前景植物基因工程生产疫苗的问题和前景 n n转基因植物可饲转基因植物可饲( (食食) )疫苗的研究还处在刚刚起步阶段、尽疫苗的研究还处在刚刚起步阶段、尽管有人已经或正在进行人体试验管有人已经或正在进行人体试验 ，但距离实际应用还有，但距离实际应用还有很大距离。许多问题尚需深人研究。很大距离。许多问题尚需深人研究。 n n5.3 .1 5.3 .1 需要解决增强转基因植物可饲需要解决增强转基因植物可饲( (食食) )疫苗的免疫原疫苗的免疫原 n n性的问题性的问题 在在 TackefTackef等报告中，生食土豆的受试者仅有等报告中，生食土豆的受试者仅有 5050可捡出粘膜分泌性可捡出粘膜分泌性 IgAIgA；在；在 MasonMason等的小鼠试验中，等的小鼠试验中，饲喂转基因土豆的鼠，饲喂转基因土豆的鼠，ELISAELISA检测检测IgAIgA抗体阳性率只有抗体阳性率只有 1010。两者的差异显然与免疫原有关因为。两者的差异显然与免疫原有关因为 LT-BLT-B本身具本身具有较好的免疫原性，且可用作粘膜免疫的佐剂，而有较好的免疫原性，且可用作粘膜免疫的佐剂，而 NVCPNVCP免疫原性较免疫原性较 羞羞 但是，即使但是，即使 LT-BLT-B也只有也只有 5o5o产生粘膜免产生粘膜免疫反应，作为可饲疫反应，作为可饲( (食食) )疫苗达到实际应用的程度，首先要疫苗达到实际应用的程度，首先要提高其免疫原性提高其免疫原性 这里有这里有 2 2个因素应考虑：一是植物本个因素应考虑：一是植物本身可能含有一些因素会影响或干扰重组蛋白的免疫原性；身可能含有一些因素会影响或干扰重组蛋白的免疫原性；二是重组蛋白在经历胃肠消化酶的作用后，可能发生降解二是重组蛋白在经历胃肠消化酶的作用后，可能发生降解或破坏。从而影响其免疫原性或破坏。从而影响其免疫原性 ，这，这 2 2个问题都需要认真个问题都需要认真研究，阐明机理并寻求解决途径研究，阐明机理并寻求解决途径 。 n n 5.3.2 5.3.2 需要考虑的是外源基因在植物中的表达量需要考虑的是外源基因在植物中的表达量的问题的问题 n n在已报告的研究中，外源基因表达的重组蛋白，在已报告的研究中，外源基因表达的重组蛋白，低的大约只占植物可溶性总蛋白的低的大约只占植物可溶性总蛋白的 0.010.01，高的，高的也只达到也只达到0.370.37。即使后者为标准，这个表达量。即使后者为标准，这个表达量作为疫苗生产系统来讲，仍然较低，需要进一步作为疫苗生产系统来讲，仍然较低，需要进一步提高，至少应能达提高，至少应能达 1 1 以上以上 n n5.3.3 5.3.3 作为凡用可食性转基因植物疫苗，土豆是作为凡用可食性转基因植物疫苗，土豆是不行的不行的 n nTackefTackef等在试验中发现，等在试验中发现，1414个生食土豆者中，有个生食土豆者中，有少数人食后有恶心等反应。作为人食用疫苗最好少数人食后有恶心等反应。作为人食用疫苗最好是香蕉和番茄，目前这是香蕉和番茄，目前这2 2种植物的外源基因果实特种植物的外源基因果实特异表达尚待研究或完善。异表达尚待研究或完善。 n n5.3.4 5.3.4 转基因植物贮存的问题转基因植物贮存的问题 作为动物饲用疫苗，作为动物饲用疫苗，土豆虽较为理想，但保存期土豆虽较为理想，但保存期 4 4也只有也只有 3 3个月。个月。如果是人食用疫苗，番茄和香蕉的储存期可能更如果是人食用疫苗，番茄和香蕉的储存期可能更短。作为转基因植物，不仅用作疫苗的组织短。作为转基因植物，不仅用作疫苗的组织( (果实果实) )本质需耐贮存，而且在贮存期内，其重组蛋白必本质需耐贮存，而且在贮存期内，其重组蛋白必须保持结构特征及生物学活性不变。须保持结构特征及生物学活性不变。 n n5.3.5 5.3.5 还应该考虑可饲还应该考虑可饲( (食食) )疫苗可能引起的免疫疫苗可能引起的免疫耐受问题耐受问题 AntzenAntzen等认为，饲等认为，饲( (食食) )用植物疫苗抗用植物疫苗抗原只要是模仿病原因子原只要是模仿病原因子( (病毒样颗粒或毒素等病毒样颗粒或毒素等) )，就不会引起免疫耐受，但同时也承认就不会引起免疫耐受，但同时也承认 ，对此还要，对此还要仔细研究。仔细研究。 n n尽管存在以上问题，但丝毫不影响转基因植物可饲(食)疫苗研究开发的前景，更何况这些问题大多可望在不长时间内得到解决。特别是动物可饲疫苗的研究，应该先行一 步。从目前来看，首先应该重点研究胃肠道传染病，因为从技术上讲容易获得突破，从实际生产上讲应用价值也最大。其他非胃肠道传染病也可研究。从已报告结果分析，有的病毒性传染病(如EMD)，获得成功的可能性很大。