第第3 3章章 同位素示踪技术同位素示踪技术中国农业大学中国农业大学 齐孟文齐孟文第第3 3章章 同位素示踪技术同位素示踪技术o同位素示踪同位素示踪 通通过过同同位位素素标标记记核核素素或或同同位位素素标标记记化化合合物物跟跟踪踪研研究究相相关关物物体体运运动动过过程程及及其其规规律律的的一一种种研研究方法。究方法。3.1 3.1 同位素示踪的基本依据和特点同位素示踪的基本依据和特点 依据依据o放射性放射性同位素同位素元素的同位素具有元素的同位素具有1)1)化学及生物学性质化学及生物学性质同一的示踪性同一的示踪性 2)2)物理性质差异的可物理性质差异的可探测性探测性 o稳定性稳定性同位素同位素元素的同位素具有元素的同位素具有1)1)化学及生物学性质化学及生物学性质同一的示踪性同一的示踪性 2)2)物理性质差异的可物理性质差异的可探测性探测性3)3)同位素的天然组成同位素的天然组成恒定恒定在水文、地理及生物学中，相关周期表中的同位素要览。点击黄色标注的元素，即可链接到相应网页，可获得关于其特性及应用的简要说明。LINK：USGS（ U.S. Geological Survey）特点特点o放射性放射性1.1.测量灵敏度高测量灵敏度高 活度检活度检测限测限A Aminmin=1Bq,=1Bq,相应物质的相应物质的质量检测限质量检测限1010-12 -12 1010- -1717g g2.2.能与内源物质相区分，能与内源物质相区分，可在生理稳恒条件进行代可在生理稳恒条件进行代谢研究。谢研究。3.3.样品制备及测定简便。样品制备及测定简便。4.4.结合显影或显像技术可结合显影或显像技术可进行定位定量或半定量测进行定位定量或半定量测定。定。o稳定性稳定性 1.现代质谱核素丰度测定的精度可达0.01%.2.利用同位素稀释原理可计算样品中的物质来自示踪剂的比率。 3.样品制备分析需大型设备。4.无放射性，无衰变，无污染。有时是唯一的。 3.2 3.2 标记核素与标记化合物标记核素与标记化合物 放射性同位素放射性同位素 常用放射性核素常用放射性核素 核素核素 半衰期半衰期 衰变方式衰变方式 粒子粒子(MeV)(MeV) 射线射线(MeV)(MeV)3 3H H 12.3y12.3y- - (100)(100)0.01860.01861414C C 5730y5730y- - (100)(100)0.1560.1563232P P14.28d14.28d- - (100)(100)1.7111.7113535S S 87.4 d87.4 d- - (100)(100)0.1670.1674545CaCa165d165d- - (100)(100)0.2580.2585959FeFe44.6d44.6d- - (100)(100)0.274(45.8)0.274(45.8)0.467(52.7)0.467(52.7)1.566(0.31.566(0.3 . .放射性同位素放射性同位素标记化合物标记化合物 化合物分子中某一元素的一个或数个普通核素原子被其放射性同位素核素原子所替代。1)1)标记方式标记方式均匀标记均匀标记U U 标记原子在相应位置均匀分标记原子在相应位置均匀分布，丰度相同，由生物合成产生。布，丰度相同，由生物合成产生。不定位标记不定位标记GG 标记原子在相应位置丰度标记原子在相应位置丰度不同，由同位素交换法产生。不同，由同位素交换法产生。定位标记定位标记 标记原子在分子中有确定位置，由标记原子在分子中有确定位置，由化学合成产生。化学合成产生。2)2)制备制备o有机合成有机合成 简单标记化合物简单标记化合物复杂标记化物复杂标记化物 如：如：o生物合成生物合成 饲喂标记前体生物系统生物大分子标记化合物。 生物合成示例生物合成示例o同位素交换同位素交换 RH+T2 RT+ HT RH+T2O RT+THO 氚标可用所谓的气爆法进行.把底物涂到石英瓶内,抽真空后,充入氚气,通过高频放电或紫外光照射使氚气活化,促进交换.反应结束,抽吸剩余氚气,用易挥发溶剂转移产物,最后除去溶剂.3)3)特点特点o组成及总量不恒定组成及总量不恒定放射性纯度放射性纯度 所需放射性核素的活度占标记化合物制剂总所需放射性核素的活度占标记化合物制剂总放射性活度的百分数放射性活度的百分数。放化纯度放化纯度 在制剂中，标记核素在特定标记化合物中的活在制剂中，标记核素在特定标记化合物中的活度占该核素总活度的百分数。度占该核素总活度的百分数。 放化纯度可用放射性薄层分析测定放化纯度可用放射性薄层分析测定。 放化纯度说明示例放化纯度说明示例 如碘-131的NaI制剂，除131I-，还可能有131I2， 若放化I-131NaI的放化纯度95%，则表示以其他化学状态存在的碘1315%。o辐射自分解辐射自分解 标记化合物的辐射对其自身所产生的离解标记化合物的辐射对其自身所产生的离解作用。作用。o微量和低浓度微量和低浓度 操作量为微居里操作量为微居里 (10(10-7-7- -14-14g )g )，因浓，因浓度低，单独不易沉淀，并易吸附损失，在操作度低，单独不易沉淀，并易吸附损失，在操作时常需加入同位素载体，以避免吸附或进行共时常需加入同位素载体，以避免吸附或进行共沉淀沉淀。4)4)贮藏贮藏o开瓶分装开瓶分装, ,降低放射性溶液的浓度，降低比活度。降低放射性溶液的浓度，降低比活度。o低温低温(2-4)(2-4)及避光保存。及避光保存。稳定性同位素稳定性同位素o名词名词核素的丰度核素的丰度 一种核素在其所属元素的同位素原一种核素在其所属元素的同位素原子中所占的原子百分数。子中所占的原子百分数。核素的自然丰度核素的自然丰度 核素在自然状态下的丰度。核素在自然状态下的丰度。核素的原子百分超核素的原子百分超 核素的丰度较自然丰度超出核素的丰度较自然丰度超出的部分。的部分。 o常用核素 常用的稳定性示踪核素列表常用的稳定性示踪核素列表Element Heavy isotopes Light isotopes H 2D (0.0156%) 1H (99.9844%) N 15N(0.366%) 14N(99.634%) C 13C(1.108%) 12C(98.892%) S 36S(0.02%) 34S(4.22%) 32S(95.02%) 33S(0.75%) O 18O(0.204%) 16O(99.759%) 17O(0.037%)o标记化合物标记化合物 通过通过富集富集标记元素的稀有同位素核素标记元素的稀有同位素核素或或贫化贫化其普通同位素核素所形成的化合物，其普通同位素核素所形成的化合物，以及核素的自然丰度因环境而异有较大的以及核素的自然丰度因环境而异有较大的同位素分馏变异，带有同位素分馏变异，带有原位原位标记标记“指纹指纹”特点的化合物。特点的化合物。3.3 3.3 试验设计的一般原则和程序试验设计的一般原则和程序放射性同位素示踪放射性同位素示踪o示踪剂的选择示踪剂的选择考虑因素 核素(射线种类、能量和半衰期)，标记方式。 例例：有机磷农药马拉硫磷残留研究，14、32、35标记均可，降解中的去甲基作用 (14CH3)，酯键的水解作用 (14，25)，硫代磷酸脂键的反应，用32P或15标记。 o示踪剂量的估算示踪剂量的估算引入量引入量 标记化合物的用量，按一般实验要求确定。标记化合物的用量，按一般实验要求确定。 放射性总活度或比活度，要求能被精确测放射性总活度或比活度，要求能被精确测量，而又不过强。量，而又不过强。 分无或有内源物示踪两种情况讨论。分无或有内源物示踪两种情况讨论。o无内源无内源 此种情况下，示踪剂在系统中未被稀释此种情况下，示踪剂在系统中未被稀释, ,化合物的化合物的比活度不变，示踪剂的比活度可由对样品活度的要求比活度不变，示踪剂的比活度可由对样品活度的要求直接估计得到。直接估计得到。 式中式中,n,nmin min 样品的最小计数，最好为样品的最小计数，最好为2000 -2000 -4000cpm;4000cpm; 仪器的仪器的计数计数效率；效率；W W 试样重量；试样重量；C C 样品中样品中示踪物的含量。示踪物的含量。 若实验期间若实验期间, ,放射性有明显衰变放射性有明显衰变, ,应进行衰变校正。应进行衰变校正。 举例举例 无无内内源源物物质质的的示示踪踪试试验验, ,如如农农药药残残留留试试验验, ,试试样样重重1 1克克, ,要要求求计计数数率率达达到到2400 2400 cpm,cpm,已已知知仪仪器器的的探探测测效效率率为为80%,80%,若若要要求求对对样样品品的的检检测测灵灵敏敏度度为为0.1ppm,0.1ppm,问问示示踪踪标标记记化化合合物物的的比比活活度度至至少少为多少为多少. .o有内源有内源 此种情况下，示踪剂在系统中被稀释。对示踪剂此种情况下，示踪剂在系统中被稀释。对示踪剂比活度的估计，除要考虑仪器的探测效率和实验期间比活度的估计，除要考虑仪器的探测效率和实验期间放射性衰减外，必需考虑稀释作用的影响。示踪剂的放射性衰减外，必需考虑稀释作用的影响。示踪剂的比活度可由如下两种方法之一估计。比活度可由如下两种方法之一估计。 估值法估值法 式中，式中，W W，C C为试样重及物质浓度或含量；为试样重及物质浓度或含量；P Pdffdff为来自示为来自示踪剂的比率。踪剂的比率。倒推法倒推法 以盆栽为例，设植株总重M2 ，试样重M1 最低计数率n (n4nb本底)。考虑：不均匀分布因子不均匀分布因子P P1 1 试样的平均计数率： 仪器的探测效率仪器的探测效率 试样的活度：总样本量总样本量M M2,2, 供试植株的总活度：验期间的衰变验期间的衰变引入时植株的活度： A322 ，植株的吸收利用率植株的吸收利用率应引入的活度：回代得到：举例举例 有内源物示踪实验示踪剂引入量的估计。以32P标记肥料实验为例，设实验持续100d,测量样品量取1g,植物平均含磷0.4%，其中来自肥料的比里率为Pdff(10%-50%),按25%估算，若样品用固闪杯法测量，仪器的探测效率为80%，要求计数率为2000cpm,试估算32P标记肥料的比活度。示踪剂的准备示踪剂的准备开瓶分装开瓶分装 对商业制剂进行必要稀释和转化的操作。工作程序工作程序 1.核查包装说 例 磷32标记磷酸氢钠制剂 1)标记化合物名称 Na4 2)物理化学状态 溶液，无色透明 3)溶液体积 5 mci/ml 4)比活度 0.5 mci/mmol 5)放射性总活度 2.5 mci 6)放射化学纯度 100% 7)测定日期 2000.3.12 8)包装情况 安培瓶盛装，再置铝罐内。2.确定稀释倍数浓度稀释关系浓度稀释关系 S0V0 =S1V1式中，S0、S1和V0、V1分别为稀释前后制剂的放射性浓(ci/ml)，及体积。比活度稀释关系比活度稀释关系: : a0m0=a1(m0+m1)式中，a0、a1分别为标记化合物稀释前后的比活度，m0和m1为标记化合的质量和所加稳定性同位素载体的质量。示踪剂的准备3.开瓶分装操作 采用屏蔽和时间防护等措施，妥善处理废物。4.使用前测定活度及放化纯度，必要时应纯化。o示踪剂的引入示踪剂的引入植物体植物体 根部根部 水培、沙培、土培。水培、沙培、土培。 地上部地上部 涂抹法、注射法、点滴法。涂抹法、注射法、点滴法。 动物体动物体 注射法、涂布渗入法、吸入法注射法、涂布渗入法、吸入法。示踪剂引入系统示例示踪剂引入系统示例1Jim Rasmussen, el at, 2007. Soil Biology Biochemistry 39,804-815.研究目的研究目的：套种体系碳、氮的转移、沉积和淋溶动态。实验布置实验布置：田间微区，插入PVC柱，内径30cm。示踪剂示踪剂：14C-尿素，15N-尿素。标记方法标记方法：叶缘吸收。植物叶片插入到盛有示踪液的小管，小管由布拉膜密封，持续标记5天。14C-尿素标记用2ml管,盛1ml标记液，活度7.7106Ci); 15N-尿素用5ml管,盛2ml 0.75%(w/v) 丰度为99%的15N-尿素标记液。在整个生育期14C标记重复3次，15N标记重复5次。2. Jessica L.Butler, el at,2004. Soil Biology Biochemistry 36,371-382.研究目的研究目的：新固定的光合作用产物在植物根际的分布与周转。实验布置实验布置：盆栽。示踪剂示踪剂：13CO2. 标记方法标记方法：整株饲喂。盆栽植物移入气密的透明有机玻璃光合室进行标记，光合室长宽高为3,每次标记11个盆。13CO2在光合室直接发生,标记开始时监测光合室CO2的浓度约为200ppm(v/v)，滴入乳酸到盛有含22.4mg NaH13CO3(13C丰度为99%),此时光合室CO2的浓度大约升到约600ppm,待CO2的浓度降到200ppm，再在另一个含13CO3管中发生13CO2,此时CO2升至400ppm,待其再次降到200ppm，将标记盆移走，放入另一光合室内一段时间，以便使呼出的13CO2被固定，使标记最大化。3.Florian wechern, el at, 2007. Soil Biology Biochemistry 39,2527-2537.研究目的研究目的：土壤根源性C和N的沉积及其归宿。实验实验：田间小区。示踪剂示踪剂：14C-蔗糖，15N-尿。标记方法：标记方法：茎部饲喂。标记溶液1ml浓度2%(w/v),13C丰度为99%的蔗糖和浓度0.5%(w/v)，15N丰度为99%的尿素。引入方法,在距根部约3cm的茎处钻的洞，用灯芯与盛标记溶液的带盖试管相连，用硅胶密封连接处。 示踪研究举例示踪研究举例 1414COCO2 2植物光合生理研究植物光合生理研究 目的目的： 测量光合强度，同化物的运转与分配，运转机理，源与库的关系及其调节，研究作物高产的光合生理。 1）1414COCO2 2标记标记 ( (1414COCO2 2+ +1212COCO2 2) )的发生。的发生。 反应方程反应方程 (HClO4 ,H3PO4) Ba14CO3+Na2CO3 (14CO2+12CO2)有关计量参量有关计量参量 光合作用二氧化碳的饱浓度为（0.12%-0.18%），一般向光合作用室引入0.1% 0.2%浓度,最高不0.5%,4CO2的放射性浓度(a )：整株标记，5Ci/L；标记单个器官，几百kBq/L；标记大型树木，100 Ci/L。 设光合作用室的体积为V(L), 二氧化碳的浓度为C(%),则,所需载体Na2CO3： Na2CO3+2 HClO4 CO2+2NaClO4+H2O X VC 所需Ba14CO3的活度A=Va 发生过程： 在光合作用室内直接发生，或预先在实验室发生，标记时注射法引入。 2）标记过程）标记过程 光合室 用聚氯乙稀（框或不框）封围供试体，扎紧，保证气密，在袋上封扎进气软胶皮导管 。 用注射器定量吸取发生好的(14CO2+12CO2）注入光合室，爆光30min后，抽出残气，用NaOH吸收。 3 3）测样方法）测样方法o固样固样 1051050 0C C杀青杀青,80,800 0C C烘干，磨碎烘干，磨碎. .取取100mg100mg，低，低本底计数或固闪杯法测量。本底计数或固闪杯法测量。o液样液样 用碱湿消化或然烧法制样后用液闪测量。用碱湿消化或然烧法制样后用液闪测量。4 4）结果分析）结果分析o1414C分配率o样品的采集和制备样品的采集和制备采集采集 代表性代表性 四分法缩减取样。四分法缩减取样。 防止交叉污染防止交叉污染 按活度由低到高顺序制备样品。按活度由低到高顺序制备样品。制备 把样品转化为适合测量与分析的形态把样品转化为适合测量与分析的形态, ,由析对由析对象和测量方式决定。象和测量方式决定。 液闪样品的制备液闪样品的制备 均相 样品在闪烁液中形成溶液。测量方式 非均相 乳浊液、悬浮液。 固体支持 样品吸附于滤膜再侵入闪 烁液。o均相样品制备法均相样品制备法1 1）溶剂提取法）溶剂提取法 侵渍法 样品匀浆振荡提取离心过滤 浓缩。 索氏抽提 用索氏器回流提取。2 2）消化法）消化法酸消化酸消化: 0.6ml 60%HClO4 50 100mg样品 0.4ml H2O2 注意14C有可能形成14CO2 ，该法淬灭较碱消化法的大。碱消化碱消化:常用无机碱或季胺碱：1ml 2M NaOH+80100 mg样品 2ml 11.5M 海胺甲醇液+400-450mg样品 3)3)燃烧法燃烧法 14CO2 被碱性吸收液吸收 样品 T2O吸收液配方： 甲苯 480 ml 乙氧基乙醇 400 ml 乙醇胺 120 ml 对142的回收率的96-98% PPO 6 g POPOP 0.2 g3)燃烧法 甲苯 800 ml 乙氧基乙醇200 ml PPO 5 g 对3H水的回收率为96-98% POPOP 0.2 go乳化样品：使样品在闪烁体系中形成胶体或乳浊液。700ml 甲苯+300ml Tritonx100+PPO (5g)+POPOP (0.5g)o固体支持：样品滴加或沉淀在滤膜(滤纸、玻璃纤维、醋酸纤维)，干燥后浸入闪烁液，相对测量。o放射性测量数据的处理放射性测量数据的处理1.1.射性计数的统计涨落射性计数的统计涨落 由于核衰变受随机过程支配，在测量条件及源强不变条件下，放射性测量计数不是定值，而是围绕某一定值上下涨落的随机变数，在计数N100时，其分布可用正态分布描述：实例实例样 品1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Ni (2min)1880,1887,1915,1851,1874,1853,1931,1866,1980,1893样 品11 12 13 14 15 16 17 18 19 20Ni (2min)1976,1876,1901,1979,1836,1832,1930,1917,1899,18901.1.放射性计数的统计涨落放射性计数的统计涨落式中式中,M,M和和 分别是分布的数学分别是分布的数学期望值和标准差，对于放射性期望值和标准差，对于放射性计数特别有计数特别有 ，即只有，即只有一个独立的统计特征量。一个独立的统计特征量。 计数计数N N出现在出现在MM 区间区间的概率：的概率：2.2.统计误差统计误差o 由一次测量结果或有限次测量的平均值作为计数期望值的估计由一次测量结果或有限次测量的平均值作为计数期望值的估计所引起的误差所引起的误差, ,一般用标准差一般用标准差N N表示：表示：结果表示为：结果表示为： 标准误差的统计意义标准误差的统计意义: :由正态分布知，任何一个计数落在由正态分布知，任何一个计数落在MM区间的概率区间的概率: : P( P(N-MN-M)68.3%68.3%反过来有反过来有: :因此，标准误差表示因此，标准误差表示NN区间包含真平均值的概率为区间包含真平均值的概率为68.3%。3.函数统计误差的运算函数Zf(x,y)的误差传递公式3.3.函数统计误差的运算函数统计误差的运算1)计数率 的误差o计算上列第一次测量的计数率及误差。解:3.3.函数统计误差的运算函数统计误差的运算2)平均计数 的误差 3)平均计数率 的误差 o计算实例所列数据的平均计数率及误差。解:3.3.函数统计误差的运算函数统计误差的运算3)平均计数率的误差 4) 净计数率的误差，扣除本底的计率 稳定性稳定性1515同位素示踪同位素示踪o示踪核素的丰度选择示踪核素的丰度选择 以15肥料利用率试验为例:式中：W施肥量或产量，N含氮量(%)，a原子百分超，R肥料利用率，f、p肥料或植物.o样品采集与制备样品采集与制备采集：代表性和防止交叉污染。制备：将样品中的氮转变成N2 供质谱或光谱分析15丰度.1)凯氏凯氏里屯伯格法里屯伯格法凯氏消煮植物 ( 1-1.5 mg N ) +5-10 ml H2SO 4土壤1-2g 2小时 清亮后，继续 5小时蒸馏定氮蒸馏定氮 在碱性条件，将氨蒸出并被硼酸吸收，然后用H2SO4滴定测量全N。样品全N含量 式中,V1 ，V0样品和对照消耗酸的体积 ，V2消煮液的定容体积，V3用于蒸馏定氮的消煮液体积。过程过程 3ml 10M NaOH/ml 消煮液 部分消煮液 定容 蒸馏 2% H3BO4（+指示剂)吸收 滴定 酸化 浓缩(2-3 ml) 密封保存里屯伯格转化里屯伯格转化 将铵转化成N2 ，为防止大气中N2的稀释在高真空装置进行。 2NH4+NaBrO+2OH- N2+5H2O3NaBr 1515样品制备样品制备 BUCHI全自动凯氏定氮仪 2 2）杜马法）杜马法( (光谱光谱) ) 样品N N2+(H2O、CO2 被CaO吸收) CO(NH2)2+3CuO N2+CO2+2H2O+3Cu 2KNO3+5Cu 22CuO过程固样 (100 g N) +CuO+CaO液样(派勒斯管) 放电管(18150) 抽真空 焙烧(马福炉) o1515丰度的质谱测定丰度的质谱测定原理原理 N2 按( )偏转分离 1515丰度的质谱测定丰度的质谱测定 离子经加速电位VD后的动能: 进入一垂直磁场后，在劳伦兹力作用下做圆周运动。 以上两式消去速度v得:质谱原理图1515丰度的质谱测定丰度的质谱测定分析公式:因此，固定R和B，通过改变VD (电压扫描)，就可在得到质谱图。MAT2611515丰度的质谱测定丰度的质谱测定o测定分析N2分子构成概率，设原子是14N的概率为p ,是15N的为q，则有:15N丰度测定 当a5%，选28和29峰分析，定义：显然 于是测定分析测定分析若a很高，采用丰度适中时，o样品分析的计量关系样品分析的计量关系 样品中的氮来自标记氮源的百分比,可由同位素稀释原理求出。据同位素稀释定理有： 式中：Ns 、Nf 植物中来自土壤及肥料的氮素,ap、af 植物及肥料样品的15N原子百分超。 由上式，植物N素来自肥料的百分比：