图位克隆的基本原理和方法何宗顺 2011.12.7图位克隆的基本原理其基本的原理是其基本的原理是：功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座，通过找到与目标性状紧密连锁的分子标记，在利用分子标记技术对目的基因精细定位的基础上，由于水稻全基因组序列的发布，我们可以得到已定位区段的候选基因，通过对候选基因进行分析，确定目标基因，最后经遗传转化试验证实目的基因功能。图位克隆的步骤： Primary mappingFine mapping Candidate geneComplementation testFunctional analysisPrimary mappingTraitmethodMappingpopulationQualitative traitsbulked segregment analysisF2、BC1Quantitative traitswhole-genome QTL screen RIL、 DH 、NILprimary mapping method and Mapping population 作图群体将纯合突变体与ZS97进行杂交，对杂交的种子进行基因型鉴定，找到杂合型种子（即种子能够发生分离），将杂合F1代种子种下去后就能得到F2代群体。 R/Rr/rR/R R/rF2 R/r r/rF1 P1 纯合突变体纯合突变体 P2ZS97 primary mapping method Bulked Segregment Analysis：群组分离分析法。原理是将分离群体(F2、BC1等)中的个体依据研究的目标性状(如抗病、感病)分成两组，每一组取样8-15份，在每一组群体中将各个体DNA等量（等浓度等体积）混合，形成两个DNA池(如抗病池和感病池)。同时需要构建两个亲本（ZH11/ZS97）的BSA池。由于分组时仅对目标性状进行选择，因此两个池间理论上就应主要在目标基因区段存在差异。ZH11ZS97HL15(W)HL15(M)HY1(W)HY1(M)HY2(W)HY2(M)HY3(W)HY3(M)HY5(W)HY5(M)ZH11ZS97HL15(W)HL15(M)ZH11ZS97HL15(W)HL15(M)将构建的BSA池分别用本室的255对在亲本ZH11/ZS97间存在多态性的SSR标记进行PCR扩增，经过跑PAGE胶找到与目标性状紧密连锁的标记。找到紧密连锁的分子标记之后我们就要进行一个“阳性”检测：即检测这个找到的分子标记是不是真正的与目标性状连锁。我们对F2代群体中随机选取一个200左右的小群体，将找到的分子标记分别扩增这些样，看表型与基因型是否对应。同时我们可以用这个小群体进行一个初步的基因定位。Fine mapping一. 表型观察二. 筛选交换单株三. 开发新的分子标记 R/Rr/rR/R R/rF2 R/r r/rF1 P1 纯合突变体纯合突变体 P2ZS97 正常表型突变表型ZH11：“A” ZS97：“B” 交换有两种带型：H和B单株 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10M1M2M3M4M5 H A A B H A A A A B H A A B A A A A A A A A A A A A A A A A A H A A A B H H A A A H H A A B B H B A基因和表型相对应！基因和表型相对应！开发新的标记：新的SSR标记： http:/redb.ncpgr.cn/modules/redbtools/ssrscan.php，运行SSRScan就会得到该段序列的简单重复序列。InDel/Caps标记：将要开发标记的日本晴区段序列与93-11做一个blast，选取插入或者缺失比较大的位点设计引物。SNPS标记:可以通过测序找到在ZH11/ZS97间存在单碱基差异的位点，或者找谢老师咨询。Candidate gene将最后精细定位区段在http:/rice.plantbiology.msu.edu/cgi-bin/gbrowse/rice/中输入定位区间的物理位置，即可显示出候选基因。精细定位扩大群体，进行精细定位找到候选基因后可对候选基因进行分析以排除非目标基因，可以通过比较扩增，测序，表达量检测及目标性状相关的生化和生理途径等方法来排除。当然最后要说明问题的话就是构建互补载体做一个互补验证。Complementation test