第三章：发酵培养基第三章：发酵培养基 培养基培养基：广义上讲培养基是指一切可供微生物细胞生长广义上讲培养基是指一切可供微生物细胞生长 繁殖繁殖 所需的一组营养物质和原料。同时培养基也为微生所需的一组营养物质和原料。同时培养基也为微生 物培养提供除营养外的其它所必须的条件。物培养提供除营养外的其它所必须的条件。 发酵培养基的作用：发酵培养基的作用： 满足菌体的生长满足菌体的生长 促进产物的形成促进产物的形成发酵培养基的要求发酵培养基的要求 培养基能够满足产物最经济的合成。培养基能够满足产物最经济的合成。 发酵后所形成的副产物尽可能的少。发酵后所形成的副产物尽可能的少。 培养基的原料应因地制宜，价格低廉；且性能稳定，资源培养基的原料应因地制宜，价格低廉；且性能稳定，资源 丰富，便于采购运输，适合大规模储藏，能保证生产上的丰富，便于采购运输，适合大规模储藏，能保证生产上的 供应。供应。 所选用的培养基应能满足总体工艺的要求，如不应该影响所选用的培养基应能满足总体工艺的要求，如不应该影响 通气、提取、纯化及废物处理等。通气、提取、纯化及废物处理等。第一节 培养基的类型及功能培养基按其组成物质的纯度、状态、用途可分为三大类型培养基按其组成物质的纯度、状态、用途可分为三大类型 一、按纯度一、按纯度 合成培养基合成培养基 : 原料其化学成分明确、稳定原料其化学成分明确、稳定 q 适合于研究菌种基本代谢和过程的物质变化规律适合于研究菌种基本代谢和过程的物质变化规律 q 培养基营养单一，价格较高，不适合用于大规模工业培养基营养单一，价格较高，不适合用于大规模工业 生产生产 天然培养基天然培养基: 采用天然原料采用天然原料 q 原料来源丰富原料来源丰富(大多为农副产品大多为农副产品)、价格低廉、适于工业、价格低廉、适于工业 化生产化生产 q 原料质量等方面不加控制会影响生产稳定性原料质量等方面不加控制会影响生产稳定性 M培养基(1L)： Na2HPO4 6g，KH2PO4 3g， NaCl 0.5g， NH4Cl 1g， MgSO4.7H2O 0.5g， CaCl2 0.011g，葡萄糖 2-10, pH 7.0 YPS培养基：酪蛋白胨（日本大五营养）10g，酵母提取物（英国Oxoid）5g, NaCl 10g，PH 7.2 培养大肠杆菌常用两种培养基培养大肠杆菌常用两种培养基二、按状态固体培养基固体培养基 :适合于菌种和孢子的培养和保存，也广泛应适合于菌种和孢子的培养和保存，也广泛应用于有子实体的真菌类，如香菇、白木耳等的生产用于有子实体的真菌类，如香菇、白木耳等的生产 半固体培养基半固体培养基: :即在配好的液体培养基中加入少量的琼脂，即在配好的液体培养基中加入少量的琼脂，一般用量为一般用量为0.5%0.8% ,主要用于微生物的鉴定。主要用于微生物的鉴定。液体培养基液体培养基:80%90%是水，其中配有可溶性的或不溶性是水，其中配有可溶性的或不溶性的营养成分，是发酵工业大规模使用的培养基。的营养成分，是发酵工业大规模使用的培养基。 三、按用途（从发酵生产应用考虑）三、按用途（从发酵生产应用考虑） 培养基按其用途可分为培养基按其用途可分为孢子（斜面）孢子（斜面）培养基、培养基、种子种子培养基培养基和和发酵发酵培养基三种培养基三种 第二节 发酵培养基的成分及来源 一、碳源一、碳源1、作用、作用提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需的碳成分的碳成分 提供合成目的产物所必须的碳成分提供合成目的产物所必须的碳成分2、来源、来源糖类、油脂、有机酸、正烷烃糖类、油脂、有机酸、正烷烃3、工业上常用的糖类、工业上常用的糖类 葡萄糖葡萄糖 所有的微生物都能利用葡萄糖所有的微生物都能利用葡萄糖 但是会引起葡萄糖效应但是会引起葡萄糖效应q 工业上常用淀粉水解糖工业上常用淀粉水解糖,但是糖液必须达到一定的质但是糖液必须达到一定的质 量指标量指标不同的制糖工艺生产的糖液质量差别很大不同的制糖工艺生产的糖液质量差别很大 糖蜜糖蜜糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物。 糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达50%75%。一般糖蜜分。一般糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜葡萄糖蜜甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜葡萄糖蜜。不用加工方法对甘蔗糖蜜的影响不用加工方法对甘蔗糖蜜的影响糖蜜使用的注意点：糖蜜使用的注意点：除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的，但是许除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的，但是许多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。例：谷氨酸发酵例：谷氨酸发酵有害物资：胶体成分（起泡、结晶）、钙盐（结晶）有害物资：胶体成分（起泡、结晶）、钙盐（结晶） 生物素（发酵控制）生物素（发酵控制）预处理：澄清预处理：澄清脱钙脱钙脱除生物素脱除生物素例：柠檬酸发酵例：柠檬酸发酵有害物质：铁离子含量高（导致异柠檬酸的生成）有害物质：铁离子含量高（导致异柠檬酸的生成）预处理：预处理：黄血盐黄血盐 淀粉、糊精淀粉、糊精使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类缺点：难利用、缺点：难利用、 发酵液比较稠、一般发酵液比较稠、一般2.0%时加入一定的时加入一定的-淀粉酶淀粉酶 成分比较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等等。成分比较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等等。优点：来源广泛、价格底优点：来源广泛、价格底 难利用，可以解除葡萄糖效应难利用，可以解除葡萄糖效应例：地衣牙孢杆菌生产例：地衣牙孢杆菌生产-淀粉酶淀粉酶碳源对生长和产酶的影响碳源对生长和产酶的影响碳源碳源 细胞量细胞量 -淀粉酶淀粉酶葡萄糖葡萄糖 4.2 0 蔗糖蔗糖 4.02 0糊精糊精 3.06 38.2淀粉淀粉 3.09 40.2李江华，无锡轻工大学学报，2004(半纤维素酶)(1.5g麸皮)嗜碱芽胞杆菌(AC-2)中碳源对碱性纤维素酶分泌的影响结果：各种碳源相差不大推论：该菌种的碱性纤维素酶为组成型苏勤，林业化学与工业，2004二、氮源二、氮源 氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：有机核酸等）和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源。氮源和无机氮源。 1、无机氮源、无机氮源种类种类：氨盐、硝酸盐和氨水：氨盐、硝酸盐和氨水特点特点：微生物对它们的吸收快，所以也称之谓迅速利：微生物对它们的吸收快，所以也称之谓迅速利用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起pH的变的变化如：化如： (NH4)2SO4 2NH3 + 2H2SO4 NaNO3 + 4H2 NH3 + 2H2O + NaOH 无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫性物质的无机氮源叫生理酸性物质生理酸性物质，如硫酸胺，若菌体代谢，如硫酸胺，若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质生理碱性物质，如，如硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的的pH有积极作用。有积极作用。 所以选择合适的无机氮源有两层意义：所以选择合适的无机氮源有两层意义： q 满足菌体生长满足菌体生长q 稳定和调节发酵过程中的稳定和调节发酵过程中的pH毛霉产蛋白酶的研究陈涛，中国酿造，2004初始pH的影响:pH偏酸比较好，中性蛋白酶影响大无机氮源的影响：硫酸铵硝酸铵硝酸钠尿素2、有机氮源、有机氮源来源来源：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，花生饼花生饼 粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋 白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒 糟糟。成分复杂成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机 盐及生长因子。盐及生长因子。例例 玉米浆：玉米浆： 可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸 较多的乳酸较多的乳酸 硫、磷、微量元素等硫、磷、微量元素等 有机氮源成分复杂可以从多个方面对发酵过程进行影响，而另一方面有机氮源的来源具有不稳定性。所以在有机氮源选取时和使用过程中，必须考虑原料的波动对发酵的影响氮源使用的一些相关问题：q 有机氮源和无机氮源应当混合使用有机氮源和无机氮源应当混合使用早期：容易利用易同化的氮源早期：容易利用易同化的氮源无机氮源无机氮源中期：菌体的代谢酶系已形成、则利用蛋白质中期：菌体的代谢酶系已形成、则利用蛋白质q 有些产物会受氮源的诱导和阻遏有些产物会受氮源的诱导和阻遏例：例： 蛋白酶的生产蛋白酶的生产q 有机氮源选取时也要考虑微生物的同化能力有机氮源选取时也要考虑微生物的同化能力q 开发效果好开发效果好、有、有针对性的有机氮源仍然是令人感兴趣针对性的有机氮源仍然是令人感兴趣 的课题的课题三、无机盐的微量元素三、无机盐的微量元素1、作用：各种不一样、作用：各种不一样2、来源：来源：C、N源，以盐的形式补充源，以盐的形式补充3、用量：根据具体的产品，以实验决定，用量：根据具体的产品，以实验决定，P1044、使用注意点使用注意点A. 对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和 微量元素在发酵过程中必须加以考虑微量元素在发酵过程中必须加以考虑例：铁离子例：铁离子 青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于20g/ml 发酵罐必须进行表面处理发酵罐必须进行表面处理B、使用时注意盐的形式（、使用时注意盐的形式（pH的变化）的变化）例例：黑曲酶黑曲酶NRRL-330,生产生产-淀粉酶，淀粉酶，P对酶活的影响对酶活的影响 pH 酶活酶活不加不加 4.25 120分钟分钟加加 K2HPO4 5.45 30分钟分钟加加 KH2PO4 4.62 75分钟分钟四、生长因子、前体和产物促进剂四、生长因子、前体和产物促进剂 从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。 1、生长因子、生长因子 如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷型，以生物素为生长因子型，以生物素为生长因子, ,生长因子对发酵的调控起到重生长因子对发酵的调控起到重要的作用要的作用 。 有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的含有较多的B簇维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺簇维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子少的生长因子 前前体体指指某某些些化化合合物物加加入入到到发发酵酵培培养养基基中中，能能直直接接彼彼微微生生物物在在生生物物合合成成过过程程中中合合成成到到产物物物物分分子子中中去去，而而其其自自身身的的结结构构并并没没有有多多大大变变化化，但但是是产产物物的的产产量量却却因因加加入入前前体体而而有有较较大大的提高。的提高。2、前体、前体青霉素：分子量青霉素：分子量356苯乙酸苯乙酸:分子量分子量136作用作用：前体有助于提高产量和组份：前体有助于提高产量和组份 P107用量用量：前体的用量可以按分子量衡算，具体使用有个转化：前体的用量可以按分子量衡算，具体使用有个转化 率的问题率的问题例：例：6000单位单位/ml的青霉素的青霉素G,需要多少苯乙酸需要多少苯乙酸 青霉素青霉素6000*0.6（微克）（微克）36mg/ml 苯乙酸（苯乙酸（36*136）/356=13.8mg/ml=1.38%实际使用时的转化率在实际使用时的转化率在46-90%之间之间 例某厂单耗为：例某厂单耗为：0.337（kg/10亿青霉素）亿青霉素） 转化率为：转化率为：0.6/(0.337*36/13.8)=68%用法用法：前体使用时普遍采用流加的方法：前体使用时普遍采用流加的方法 前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利 苯乙酸，一般基础料中仅仅添加苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07% 前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化，前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化， 流加也有利于提高前提的转化率流加也有利于提高前提的转化率3、产物促进剂、产物促进剂 所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。 促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方面的。面的。 有些促进剂本身是酶的诱导物；有些促进剂本身是酶的诱导物； 有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善 细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产，细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产， 也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用；也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用； 有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。五、水五、水 对于发酵工厂来说，恒定的水源是至关重要的，因为在对于发酵工厂来说，恒定的水源是至关重要的，因为在不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大。不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大。 水源质量的主要考虑参数包括水源质量的主要考虑参数包括pH值、溶解氧、可溶值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。 对于酿造行业，水的重要性不言而喻对于酿造行业，水的重要性不言而喻对于常规发酵，可靠、持久，能提供大量成分一致清洁的对于常规发酵，可靠、持久，能提供大量成分一致清洁的水。水。第三节 发酵培养基的设计和优化 目前还不能完全从生化反应的基本原理来推断和计算目前还不能完全从生化反应的基本原理来推断和计算出适合某一菌种的培养基配方，只能用生物化学、细胞生出适合某一菌种的培养基配方，只能用生物化学、细胞生物学、微生物学等的基本理论，参照前人所使用的较适合物学、微生物学等的基本理论，参照前人所使用的较适合某一类菌种的经验配方，再结合所用菌种和产品的特性，某一类菌种的经验配方，再结合所用菌种和产品的特性，采用摇瓶、玻璃罐等小型发酵设备，按照一定的实验设计采用摇瓶、玻璃罐等小型发酵设备，按照一定的实验设计和实验方法选择出较为适合的培养基。和实验方法选择出较为适合的培养基。 一、培养基成分选择的原则 q 菌种的同化能力菌种的同化能力q 代谢的阻遏和诱导代谢的阻遏和诱导 q 合适的合适的C、N比比100 0.22.0q pH的要求的要求 （一）、（一）、理论转化率与实际转化率理论转化率与实际转化率 理论转化率是指理想状态下根据微生物的代谢途理论转化率是指理想状态下根据微生物的代谢途径进行物料衡算，所得出的转化率的大小。径进行物料衡算，所得出的转化率的大小。 实际转化率是指实际发酵过程中转化率的大小实际转化率是指实际发酵过程中转化率的大小 如何使实际转化率接近于理论转化是发酵控制的一个如何使实际转化率接近于理论转化是发酵控制的一个目标目标 二、成分含量的确定二、成分含量的确定例例: 如在酒精生产中葡萄糖转化为酒精的理论转化率计算如下如在酒精生产中葡萄糖转化为酒精的理论转化率计算如下 葡萄糖转化为酒精的代谢总反应衡算式为葡萄糖转化为酒精的代谢总反应衡算式为 C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 葡萄糖转化为酒精的理论得率为葡萄糖转化为酒精的理论得率为 2*46 Y = = 0.57 162（二）、实验设计q 培养基成分的含量最终都是通过实验获得的q 合理的实验方法多因子实验：均匀设计、 正交实验设计、 响应面分析等。多因子实验 当培养基成分确定后，剩下的问题就是各成分最适 的浓度，由于培养基成分很多，为减少实验次数常采 用一些合理的实验设计方法。 三、培养基设计的步骤 根据前人的经验和培养基成分确定时一些必须考虑 的问题，初步确定可能的培养基成分； 通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分；类胡萝卜素高产菌Y11的培养基的优化郭秒,食品与工业发酵，2004类胡萝卜素的作用：色素、营养保健原培养基: 初步确定可能的培养基成分(以碳源为例) 通过单因子实验确定适宜的培养基成分(以碳源为例)考虑到成本：乙酸钠是较为合适的碳源进一步：乙酸钠的浓度2%比较好结果：碳源：乙酸钠 0. 2%氮源：氯化铵 0.2% 酵母膏0.03%无机盐: 复合无机盐0.05% 正交设计确定优化的配方改进后培养基原培养基第三章 发酵培养基改进后培养基的发酵结果四、摇瓶水平到反应器水平的优化配方摇瓶、反应器培养基研究的两个层次q 摇瓶培养基设计的第一步q 反应器最终的优化的基础配方例： 青霉素发酵发酵摇瓶：玉米浆4%，乳糖10%，(NH4)SO4 0.8% 轻质碳酸钙1%发酵罐:葡萄糖流加控制总量10-15%，玉米浆总量4-8% 补加硫酸、前体等摇瓶发酵培养基和罐的基础培养差别很大摇瓶优化配方：菌种筛选，反应器研究的基础发酵罐：反应器水平, 可以得出最 终优化的基 础配方pH控制摇床：反应器水平上的摇瓶研究五、培养基设计时注意的一些相关问题五、培养基设计时注意的一些相关问题 q 原料及设备的预处理原料及设备的预处理 q 原材料的质量原材料的质量 q 发酵特性的影响发酵特性的影响 在抗生素发酵生产中往往喜欢所谓的在抗生素发酵生产中往往喜欢所谓的“稀配方稀配方”，因为它既降低成本、灭菌容易、且使氧传，因为它既降低成本、灭菌容易、且使氧传递容易而有利于目的产物的生物合成。如果营递容易而有利于目的产物的生物合成。如果营养成分缺乏，则可通过中间补料方法予以弥补。养成分缺乏，则可通过中间补料方法予以弥补。 q 灭菌灭菌 在大规模发酵中应该尽可能的采取连续灭菌的操作，在大规模发酵中应该尽可能的采取连续灭菌的操作，而且保证灭菌条件的稳定是保证发酵稳定的前提而且保证灭菌条件的稳定是保证发酵稳定的前提 有时避免营养物质在加热的条件下，相互作用，有时避免营养物质在加热的条件下，相互作用，可以将营养物质分开消毒。可以将营养物质分开消毒。 有些物质由于挥发和对热非常敏感，就不能采用湿有些物质由于挥发和对热非常敏感，就不能采用湿热的灭菌方法热的灭菌方法 Na2HPO4+CaCO3CaHPO4+Na2CO3第四节、重组产品培养基的介绍q 大肠杆菌高密度度培养：碳源：葡萄糖、甘油氮源：胰蛋白胨、酵母粉无机盐：磷、镁等蛋白胨、酵母粉(OXOID)章越，生物工程学报，2004q 动物细胞培养基基础培养基:F12、DMEM等血清(5-10%)：胎牛(FBS) 、小牛(CS) 、马(HS)水：超纯水其它：NaHCO3（CO2）、抗生素GONG,J. B. B. 2003本章小节：q 培养基菌体生长所需的营养以及其它必须的条件q 了解发酵培养基的组成，发酵培养基常用的原料以 及其中的基本概念q 发酵培养基的优化与设计是发酵工程的基本问题， 掌握发酵培养基优化与设计的思路、了解其中的 方法