1 紫外可见分光光度计 Ultraviolet and Visible Spectrophotometer 2概述分分光光光光度度法法是基于物质分子对光的选择性吸收而建立起来的分析方法。按物质吸收光的波长不同，可分为可见分光光度法、紫外分光光度法及红外分光光度法。特点：*灵敏度较高（110mgL-1），适用于微量组分的测定。但相对误差较大（25%）。*具有操作方便、仪器设备简单、灵敏度和选择性较好等优点，为常规的仪器分析方法。3 光的吸收定律Lambert-beer定律朗伯比尔定律当一束平行的单色光照射到有色溶液时，光的一部分将被溶液吸收，一部分透过溶液，还有一部分被器皿表面所反射。设入射光强度为I0，透过光强度为I，溶液的浓度为c，液层宽度为b，经实验表明它们之间有下列关系：(1-1)4透光度、吸光度与溶液浓度及液层宽度的关系 （1-2） 溶液浓度与宽度的乘积与吸光度成正比，而不是与透光度成正比。以上两式中k是比例系数，与入射光波长、溶液的性质及温度有关。当入射光波长和溶液温度一定时，k代表单位浓度的有色溶液放在单位宽度的比色皿中的吸光度.。当c的单位为gL-1，b的单位为cm时，k以a表示，称为吸光系数(absorption coefficient)，其单位为Lg-1cm-1，此时式（9-3）变为 (1-3)5 如果浓度c的单位为molL-1，b的单位为cm，这时k常用 表示。称为摩尔吸光系数(molar absorptivity)，其单位为Lmol-1cm-1，它表示吸光质点的浓度为1molL-1，溶液的宽度为1cm时，溶液对光的吸收能力。 值越大，表示吸光质点对某波长的光吸收能力愈强，故光度测定的灵敏度越高。值在103以上即可进行分光光度法测定，高灵敏度的分光光度法可达到105106。于是式（1-1）可写成为：A=bc （1-4）与a的关系为：=Ma （1-5） 式中M为吸光物质的摩尔质量6紫外可见分光光度计基本构造单色器光源检测器吸收池信号显示系统7光源光源(light source(light source) ：在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。可见光区：可见光区：钨灯、卤钨灯、氙灯，其辐射波长范围在钨灯、卤钨灯、氙灯，其辐射波长范围在3203202500 2500 nmnm。钨灯最适宜的使用波长范围为钨灯最适宜的使用波长范围为3203201000nm1000nm。紫外区：紫外区：氢、氘灯。发射氢、氘灯。发射185185400 400 nmnm的连续光谱。的连续光谱。使用波长范围一般为使用波长范围一般为190190360nm 360nm 。8 单色器单色器(monochromator)(monochromator) ：其作用是将光源辐射的复合光分解成按波长顺序排列的单色光。包括狭缝和色散元件及准直镜三部分。色散元件用棱镜或光栅制成。光栅其特点是工作波段范围宽，适用性强，对各种波长色散率几乎一致。光栅由玻璃片或金属片制成，其上准确地刻有大量宽度和距离都相等的平行线条（刻痕），可近似地将它看成一系列等宽度和等距离的透光狭缝。9吸收池吸收池(absorption cell)(absorption cell)又称比色皿，是由无色透明的光学玻璃或熔融石英制成，用于盛装试液或参比溶液。玻璃吸收池：在见光范围内使用。石英吸收池：在紫外光范围内使用。吸收池，通常有、1cm、2cm、3cm和5cm宽，可适用于不同浓度范围的试样测定。同一组吸收池的透光率相差应小于0.5%。10检测器检测器(detector)(detector) 把透过吸收池后透射光强度转换成电讯号的装置。 检测系统应具有灵敏度高、对透过光的响应时间短、且响应的线性关系好，对不同波长的光具有相同的响应可靠性。在分光光度计中常用光电管和光电倍增管等做检测器。光电倍增管其灵敏度要比光电管约高200倍。11显示器(display) 显示器是将检测器检测的信号显示和记录下来的装置。在分光光度计中常用的是微安表、数码显示管等。简单的分光光度计多用微安表。在标尺上有透光度（T）和吸光度（A）两种刻度，由于吸光度和透光度是负对数关系，因此透光度的刻度是均匀的，而吸光度的刻度是不均匀的。12分光光度计的主要类型131.1.单光单光束束：经单色器分光后的一束平行光，轮流通过参比溶液和样品溶液，以进行吸光度的测定。这种简易型分光光度计结构简单，操作方便，维修容易，适用于常规分析。2.2.双光束双光束：经单色器分光后经反射镜分解为强度相等的两束光，一束通过参比池，一束通过样品池。光度计能自动比较两束光的强度，此比值即为试样的透射比，经对数变换将它转换成吸光度并作为波长的函数记录下来。快速全波段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。仪器复杂，价格较高。3 3. .双波长双波长：由同一光源发出的光被分成两束，分别经过两个单色器，得到两束不同波长（1和2）的单色光；利用切光器使两束光以一定的频率交替照射同一吸收池，然后经过光电倍增管和电子控制系统，最后由显示器显示出两个波长处的吸光度差值A。对于多组分混合物、混浊试样（如生物组织液）分析，以及存在背景干扰或共存组分吸收干扰的情况下，利用双波长分光光度法，往往能提高方法的灵敏度和选择性。利用双波长分光光度计，能获得导数光谱。14 定量分析时，通常液层厚度是相同的，按照比尔定律，浓度与吸光度之间的关系应该是一条通过直角坐标原点的直线。但在实际工作中，往往会偏离线性而发生弯曲。若在弯曲部分进行定量，将产生较大的测定误差。偏离朗伯一比尔定律的原因15 朗伯一比尔定律只对一定波长的单色光才能成立，但在实际工作中，即使质量较好的分光光度计所得的入射光，仍然具有一定波长范围的波带宽度。在这种情况下，吸光度与浓度并不完全成直线关系，因而导致了对朗伯一比尔定律的偏离。所得入射光的波长范围越窄，即“单色光”越纯，则偏离越小。 单色光不纯所引起的偏离16由于溶液本身的原因所引起的偏离 吸光系数k与溶液的折光指数n有关。溶液浓度在L-1或更低时，n基本上是一个常数，说明朗伯一比尔定律只适用于低浓度的溶液。浓度过高会偏离朗伯一比尔定律。 朗伯比尔定律是建立在均匀、非散射的溶液这个基础上的。如果介质不均匀，呈胶体、乳浊、悬浮状态，则入射光除了被吸收外，还会有反射、散射的损失，因而实际测得的吸光度增大，导致对朗伯比尔定律的偏离。17 溶质的离解、缔合、互变异构及化学变化也会引起偏离。其中有色化合物的离解是偏离朗伯比尔定律的主要化学因素。例如，显色剂KSCN与Fe3+形成红色配合物Fe(SCN)3，存在下列平衡：Fe(SCN)3 Fe3+3SCN溶液稀释时，上述平衡向右，离解度增大。所以当溶液体积增大一倍时，Fe(SCN)3的浓度不止降低一半，故吸光度降低一半以上，导致偏离朗伯比尔定律。18紫外可见分光光度法的误差和测量条件的选择分光光度法的误差 溶液不遵守朗伯溶液不遵守朗伯比尔定律所引起的误差比尔定律所引起的误差 利用标准曲线的直线段来测定被测溶液的浓度，从而减少由入射光为非单色光引起的误差；也可以利用试剂空白和确定适宜的浓度范围来减少由溶液本身所引起的误差。 光度测量误差光度测量误差 吸光度与透光率是负对数关系，故吸光度的标尺刻度是不均匀的。一般来说透光率为2065（吸光度为）时，浓度测量的相对误差都不太大。这就是分光光度分析中比较适宜的吸光度范围。19仪器误差仪器误差 比色皿的质量，检流计的灵敏度。，光源不稳定、棱镜的性能、安装条件及光电管的质量等都可以使分析产生误差。操作误差操作误差 由分析人员所采用的实验条件与正确的条件有差别所引起的，如显色条件和测量条件掌握得不好等。20 吸光度读数范围的选择吸光度读数范围的选择 透光度读数误差T是一个常数，但在不同的读数范围内所引起的浓度的相对误差却是不同的。因此，为了减小浓度的相对误差，提高测量的准确度，一般应控制被测液的吸光度A在（透光度为65%20%）。当溶液的吸光度不在此范围时，可以通过改变称样量、稀释溶液以及选择不同厚度的比色皿来控制吸光度。21一、 仪器测量条件的选择由朗伯-比尔定律可知： A=lg1/T=cl 微分后得：dcT/T= -lc代入朗伯-比尔定律有：要使测定的相对误差c/c最小，求导取极小得出： lgT=-0.4343=A即当时，吸光度测量误差最小22紫外可见分光光度法应用实例应用: 测量试样微量组分 测定配合物的组成及稳定常数、弱酸的解离常数、化学反应的速率常数、催化反应的活化能等. 根据分子的紫外光谱数据判断分子的空间构型，确定分子结构。1、波长准确度和波长重复性232、透射比准确度及透射比重复性243、杂散光4、波长边缘噪声255、电源电压变化时引起的透射比变化电源电压220 V变化+22 V时所引起透射比示值变化不应超过下表的要求。2627