第十章第十章DNA诱变诱变突变是研究基因结构与功能的最基本手段。突变是研究基因结构与功能的最基本手段。经典方法：经典方法：分离自发突变体或用物理、化学诱变剂处理活体来获分离自发突变体或用物理、化学诱变剂处理活体来获得突变，再根据突变体的表型，采用遗传学方法鉴定相应基因。得突变，再根据突变体的表型，采用遗传学方法鉴定相应基因。体外诱变：体外诱变：对克隆化的对克隆化的DNA进行诱变处理，改变其核苷酸序列，进行诱变处理，改变其核苷酸序列，从而获得突变基因，用于基因工程、蛋白质工程等研究。从而获得突变基因，用于基因工程、蛋白质工程等研究。定向进化的原理定向进化的原理第一节第一节 随机诱变随机诱变体外随机诱变：体外随机诱变：指随机地在克隆化指随机地在克隆化DNA中引入碱基置换突变。中引入碱基置换突变。特点：特点：不需要有序列针对性的合理设计，引入突变的位置随机；不需要有序列针对性的合理设计，引入突变的位置随机；结果：结果：在目的在目的DNA片段中引入大量的序列多样性；片段中引入大量的序列多样性；方法：方法：错误掺入诱变、增变菌株诱变、盒式诱变、化学诱变；错误掺入诱变、增变菌株诱变、盒式诱变、化学诱变；用途：用途：诱变基因的编码区，改变氨基酸序列，从而改造蛋白质的诱变基因的编码区，改变氨基酸序列，从而改造蛋白质的性质或活性，得到符合需要的蛋白质。性质或活性，得到符合需要的蛋白质。定向进化：定向进化：对于某些实验目的，一次突变很难获得满意的结果，对于某些实验目的，一次突变很难获得满意的结果，通常采用反复多次诱变和循环，其目的是获得满足人们需要的性通常采用反复多次诱变和循环，其目的是获得满足人们需要的性能改良的蛋白质，又称为能改良的蛋白质，又称为试管进化试管进化。一、错误掺入突变一、错误掺入突变概念：概念：在体外在体外DNA扩增中，使用具有错配倾向的扩增中，使用具有错配倾向的DNA聚合酶聚合酶以及反应条件，使碱基错误掺入到新合成的基因中，又称易错以及反应条件，使碱基错误掺入到新合成的基因中，又称易错PCR（error-pronePCR）。）。error-pronePCR的实质：的实质：通过改变通过改变PCR反应条件来调整反应条件来调整PCR反应中突变的频率，降低聚合酶固有的突变序列倾向性，提高反应中突变的频率，降低聚合酶固有的突变序列倾向性，提高突变谱的多样性，使得错误碱基随机地以一定的频率掺入到扩突变谱的多样性，使得错误碱基随机地以一定的频率掺入到扩增的基因中，从而得到随机突变的增的基因中，从而得到随机突变的DNA群体，最后用合适的群体，最后用合适的载体克隆突变基因。载体克隆突变基因。易错易错PCR采用的方法：采用的方法：增加增加MgCl2浓度到浓度到7mM，稳定非互补的碱基配对；，稳定非互补的碱基配对；加入加入0.5mM的的MnCl2，Mn2+能降低聚合酶对模板的特异性；能降低聚合酶对模板的特异性；增加聚合酶量到增加聚合酶量到5U，促使在错配碱基处继续延伸反应；，促使在错配碱基处继续延伸反应；限定限定4种碱基中的一种，通常为正常浓度的种碱基中的一种，通常为正常浓度的1-10%，在缺乏正，在缺乏正确核苷酸时，确核苷酸时，DNA聚合酶经短暂停顿后，会插入另外聚合酶经短暂停顿后，会插入另外3种可用种可用核苷酸的一种；核苷酸的一种；3种为正常浓度的正常碱基，第四种为次黄嘌呤种为正常浓度的正常碱基，第四种为次黄嘌呤dITP（可与（可与C、T、A配对）；配对）；增加增加dCTP和和dTTP的浓度到的浓度到1mM，促进错误掺入；，促进错误掺入；使用突变使用突变DNA聚合酶，如聚合酶，如Mutazyme。二、盒式诱变二、盒式诱变盒式取代诱变盒式取代诱变混合寡核苷酸诱变混合寡核苷酸诱变盒式取代诱变盒式取代诱变种类种类简单的简单的盒式取代诱变盒式取代诱变是通是通过限制性酶切除去特定的过限制性酶切除去特定的双链双链DNA片段，再与含有片段，再与含有突变的单一序列双链寡核突变的单一序列双链寡核苷酸连接苷酸连接,得到取代突变，得到取代突变，是一种定点诱变。是一种定点诱变。混合寡核苷酸诱变混合寡核苷酸诱变混合寡核苷酸诱变：混合寡核苷酸诱变：若用若用于取代的是含有随机突变于取代的是含有随机突变的混合双链寡核苷酸，则的混合双链寡核苷酸，则可在限定区域内引入大量可在限定区域内引入大量的随机突变。的随机突变。三、增变菌株的诱变作用三、增变菌株的诱变作用概念：概念：与与DNA错配校正功能和错配校正功能和DNA损伤修复有关的基因突变后，损伤修复有关的基因突变后，细胞内基因的突变频率大大增加，这样的菌株叫细胞内基因的突变频率大大增加，这样的菌株叫增变菌株增变菌株（mutatorstrain）。）。常用增变菌株：常用增变菌株：E.coliXL1-Red(mutD mutS mutT)mutD突变突变造成造成DNA聚合酶聚合酶的的35外切核酸酶活性缺陷，失外切核酸酶活性缺陷，失去错配碱基的校正功能；去错配碱基的校正功能；mutS突变突变使使DNA错配修复系统失去功能；错配修复系统失去功能；mutT突变突变不能水解不能水解dGTP的氧化产物的氧化产物8-oxodGTP，8-羟基鸟嘌呤羟基鸟嘌呤在复制时掺入在复制时掺入DNA中，造成突变。中，造成突变。四、化学诱变四、化学诱变用化学诱变剂处理双链用化学诱变剂处理双链DNA片段，将发生随机突变的片段群片段，将发生随机突变的片段群体克隆到合适的宿主中，构建成一个重组突变体库。用适当体克隆到合适的宿主中，构建成一个重组突变体库。用适当的功能分析可鉴别携带突变的重组子。的功能分析可鉴别携带突变的重组子。常用的化学诱变剂：常用的化学诱变剂：1.烷基磺酸盐和烷基硫酸盐烷基磺酸盐和烷基硫酸盐甲基磺酸乙酯（甲基磺酸乙酯（EMS）、硫酸二乙酯（）、硫酸二乙酯（DES）2.亚硝基烷基化合物亚硝基烷基化合物亚硝基乙基脲（亚硝基乙基脲（NEH）、）、N-亚硝基亚硝基-N-乙基脲烷（乙基脲烷（NEU）3.次乙胺和环氧乙烷类次乙胺和环氧乙烷类乙烯亚胺（乙烯亚胺（EI）4.芥子气类芥子气类氮芥类、硫芥类氮芥类、硫芥类烷化剂烷化剂作用机制作用机制作用重点是核酸，导致作用重点是核酸，导致DNA断裂、缺失或修补。断裂、缺失或修补。这类化合物具有与这类化合物具有与DNA碱基类似的结构。碱基类似的结构。代表药剂：代表药剂：5-溴尿嘧啶（溴尿嘧啶（BU）、）、5-溴去氧尿核苷（溴去氧尿核苷（BudR）为胸腺嘧啶（为胸腺嘧啶（T）的类似物）的类似物2-氨基嘌呤（氨基嘌呤（AP）为腺嘌呤（为腺嘌呤（A）的类似物）的类似物马来酰肼（马来酰肼（MH）为尿嘧啶（为尿嘧啶（U）的异构体）的异构体 核酸碱基类似物核酸碱基类似物亚硝酸亚硝酸能使嘌呤或嘧啶脱氨，改变核酸结构和性质，造成能使嘌呤或嘧啶脱氨，改变核酸结构和性质，造成DNA复制紊乱。复制紊乱。HNO2还能造成还能造成DNA双链间的交联而引起遗传效应。双链间的交联而引起遗传效应。叠氮化钠叠氮化钠(NaN3)是一种呼吸抑制剂，能引起基因突变，可获得较高的突变是一种呼吸抑制剂，能引起基因突变，可获得较高的突变频率，而且无残毒。频率，而且无残毒。 其它诱变剂其它诱变剂作用机制作用机制作为作为DNA的成份而渗入到的成份而渗入到DNA分子中去，使分子中去，使DNA复制时发生配对错误，从而引起有机体变异。复制时发生配对错误，从而引起有机体变异。第二节第二节DNA体外重组体外重组依赖序列同源性的依赖序列同源性的DNA体外重组技术。体外重组技术。要求：要求：DNA亲本序列之间要有一定程度的同源性，重组交换在局亲本序列之间要有一定程度的同源性，重组交换在局部序列完全相同的片段内发生。部序列完全相同的片段内发生。关键：关键：引入引入DNA片段的重新组装过程，又称有性片段的重新组装过程，又称有性PCR（sexualPCR）或分子育种）或分子育种PCR（molecularbreedingPCR）。）。优点：优点：可以将大量突变中的有益突变快速地组合，加速产生可以将大量突变中的有益突变快速地组合，加速产生DNA序列多样性，使定向进化从以往的序列多样性，使定向进化从以往的“突变突变选择选择”模式变为与自模式变为与自然进化更为相似的然进化更为相似的“突变突变重组重组选择选择”模式。模式。一、一、DNA洗牌法洗牌法（DNAshuffling）美国美国Stemmer于于1994年首次提出年首次提出。DNAshuffling技术技术是通过对一组序列相关是通过对一组序列相关DNA序列，经过超声波处理序列，经过超声波处理或在或在DNaseI的作用下随机切成小片段，然后在没有引物的情况下，采用有的作用下随机切成小片段，然后在没有引物的情况下，采用有性性PCR方法进行合成；随着循环数的增加，方法进行合成；随着循环数的增加，PCR产物将越来越接近切割前产物将越来越接近切割前的目的基因的长度；最后用基因两侧的引物合成全长的基因。的目的基因的长度；最后用基因两侧的引物合成全长的基因。DNAshuffling技术的优点：技术的优点：可在短时间内通过重组有效的突变体发可在短时间内通过重组有效的突变体发掘所有可能的重组体与突变序列，从而大大加快进化速度；而且对可操作掘所有可能的重组体与突变序列，从而大大加快进化速度；而且对可操作的靶序列没有任何要求，长度可达几十的靶序列没有任何要求，长度可达几十kb;通过多轮筛选或选择，可以使通过多轮筛选或选择，可以使有益突变迅速积累，导致功能的明显提高；有益突变迅速积累，导致功能的明显提高；从表型上早期进行选择，而从表型上早期进行选择，而不必了解不必了解DNA片段上序列的信息，简化了操作程序；片段上序列的信息，简化了操作程序；比随机突变显著提比随机突变显著提高了良性突变的概率。高了良性突变的概率。二、交错延伸重组二、交错延伸重组（staggered extension processstaggered extension process）交错延伸重组是一种简化的交错延伸重组是一种简化的DNAshuffling技术。技术。它不是由短片段组它不是由短片段组装全长基因，而是在装全长基因，而是在PCR样反应中样反应中将含不同点突变的模板混合，随之将含不同点突变的模板混合，随之进行多轮变性、短暂（进行多轮变性、短暂（5sec）复性）复性/延伸反应，在每一轮延伸反应，在每一轮PCR循环中，循环中，那些部分延伸的片段可以随机地杂那些部分延伸的片段可以随机地杂交到含不同突变的模板上继续延伸，交到含不同突变的模板上继续延伸，由于模板转换而实现不同模板间的由于模板转换而实现不同模板间的重组，这样重复直到获得全长基因重组，这样重复直到获得全长基因片段，重组的程度可通过调整反应片段，重组的程度可通过调整反应时间和温度来控制。时间和温度来控制。三、随机引发重组三、随机引发重组(randompriminginvitrorecombination，RPR)RPR以单链以单链DNA为模板，配合一套随机序列引物，先产生为模板，配合一套随机序列引物，先产生大量互补于模板不同位点的短大量互补于模板不同位点的短DNA片段，由于碱基的错配片段，由于碱基的错配和错误引发，这些短和错误引发，这些短DNA片段中也会有少量的点突变，在片段中也会有少量的点突变，在随后的随后的PCR反应中，它们互为引物进行合成，伴随组合，反应中，它们互为引物进行合成，伴随组合，再组装成完整的基因长度。再组装成完整的基因长度。该法可以用一条该法可以用一条DNA单链为模板，因此可以直接以单链为模板，因此可以直接以cDNA为模板进行随机引发重组。为模板进行随机引发重组。随机引发合成短随机引发合成短DNA片段混合物；片段混合物；过滤并纯化过滤并纯化DNA片片段混合物；段混合物；做无引物做无引物PCR；用两端引物进行标用两端引物进行标准准PCR，扩增全长，扩增全长的杂交的杂交DNA链。链。第三节第三节 寡核苷酸介导的定点诱变寡核苷酸介导的定点诱变70年代初年代初x174DNA（ssDNA5386bp），当用带琥珀突变的），当用带琥珀突变的ssDNA与变性的野生型与变性的野生型DNA片段一起转染细菌时，观察到片段一起转染细菌时，观察到“标记获救标记获救”现象，即产生带野生型基因组的噬菌体。现象，即产生带野生型基因组的噬菌体。一、寡核苷酸介导定点诱变的基本流程一、寡核苷酸介导定点诱变的基本流程化学合成能与野生型化学合成能与野生型DNA模板的靶区域退火，并携带所需模板的靶区域退火，并携带所需突变的寡核苷酸，作为体外合成突变的寡核苷酸，作为体外合成DNA的引物。的引物。由由DNA聚合酶根据模板序列延伸寡核苷酸，产生含有预定聚合酶根据模板序列延伸寡核苷酸，产生含有预定突变的双链突变的双链DNA。对突变体对突变体DNA进行测序，验证靶点的突变，并确保其他区进行测序，验证靶点的突变，并确保其他区域没有发生额外的突变。域没有发生额外的突变。二、诱变寡核苷酸的设计要求二、诱变寡核苷酸的设计要求与靶与靶DNA的适当链互补，并注意与模板的其他区域不能错的适当链互补，并注意与模板的其他区域不能错误杂交；误杂交；足够的长度与靶序列特异地结合，足够的长度与靶序列特异地结合，1-2个碱基改变的引物要个碱基改变的引物要求至少求至少25个碱基长度；个碱基长度；错配碱基位于中央位置，使每侧有错配碱基位于中央位置，使每侧有10-15个碱基与模板链完个碱基与模板链完全匹配；全匹配；含有与模板完全杂交的含有与模板完全杂交的5端区，这样从上游引物起始的端区，这样从上游引物起始的DNA合成不至于取代诱变寡核苷酸引物；合成不至于取代诱变寡核苷酸引物；诱变寡核苷酸引物诱变寡核苷酸引物3区域有区域有10-15个碱基与模板链完全匹配，个碱基与模板链完全匹配，形成足够稳定的杂交分子；形成足够稳定的杂交分子；无回纹、重复或自身互补序列；无回纹、重复或自身互补序列；必要时可在诱变寡核苷酸上加入新的酶切位点，或消除靠必要时可在诱变寡核苷酸上加入新的酶切位点，或消除靠近诱变点的已有酶切位点。近诱变点的已有酶切位点。三、经典三、经典DNA定点诱变定点诱变在在PCR技术得到广泛使用之前，定点诱变程序均采用普通的技术得到广泛使用之前，定点诱变程序均采用普通的DNA聚合酶催化聚合酶催化DNA的复制。通常以单链的复制。通常以单链DNA为模板，大部为模板，大部分方案利用了分方案利用了M13噬菌体可制备单链噬菌体可制备单链DNA的特点。的特点。M13噬菌体噬菌体是一种丝状噬菌体，只感染雄性大肠杆菌，不裂解大肠杆菌细是一种丝状噬菌体，只感染雄性大肠杆菌，不裂解大肠杆菌细胞，可形成模糊噬菌斑，其基因组为闭合环状胞，可形成模糊噬菌斑，其基因组为闭合环状DNA，插入，插入M13的的DNA可以分别回收到两种形式：可以分别回收到两种形式：dsDNA和和ssDNA。1.背景知识背景知识dut-：dUTP酶（酶（dUTPase）缺陷，细胞不能把）缺陷，细胞不能把dUTP转化为转化为dUMP，因此细胞内，因此细胞内dUTP的含量大为增加，其中一些的含量大为增加，其中一些dUTP可可掺入掺入DNA中正常情况下由中正常情况下由T占据的位置。占据的位置。ung-：UDG酶缺陷，酶缺陷，UDG酶酶尿嘧啶尿嘧啶-N-糖基化酶糖基化酶可除去掺入可除去掺入DNA中的尿嘧啶残基中的尿嘧啶残基在体外用诱变引物合成的杂合双链在体外用诱变引物合成的杂合双链DNA在导入正常在导入正常ung+ dut+菌菌株后，只有带有突变位点的新合成链和作模板进一步复制，而株后，只有带有突变位点的新合成链和作模板进一步复制，而野生型不能复制。这样能够生长的细胞就带有突变位点。野生型不能复制。这样能够生长的细胞就带有突变位点。（一）（一）Kunkel定点诱变法（又称定点诱变法（又称“U”法）法）（二）位点选择诱变（二）位点选择诱变（alteredsitesinvitromutagenesis）位点选择诱变法使用了位点选择诱变法使用了2个寡核苷酸引物，一个是用来引入突变个寡核苷酸引物，一个是用来引入突变的引物，另一个是用来选择用的。选择性引物可用来恢复有缺陷的引物，另一个是用来选择用的。选择性引物可用来恢复有缺陷的抗生素抗性基因，同时可用来选择引入突变的的抗生素抗性基因，同时可用来选择引入突变的DNA链。链。特点：特点：可正向选择突变链，使用高保真的可正向选择突变链，使用高保真的T4DNA聚合酶合成聚合酶合成DNA，可以使用双良，可以使用双良DNA作模板，可进行多轮筛选。但需特定载作模板，可进行多轮筛选。但需特定载体，即含有一个有缺陷的抗生素抗性基因。体，即含有一个有缺陷的抗生素抗性基因。（三）转化子诱变（三）转化子诱变（transformersite-directedmutagenesis）转化子诱变也使用了转化子诱变也使用了2个寡核苷酸引物，除了突变引物外，还使个寡核苷酸引物，除了突变引物外，还使用了用了1个用来剔除单一酶切位点的引物。因此该方法也称酶切位个用来剔除单一酶切位点的引物。因此该方法也称酶切位点剔除法。将待突变的点剔除法。将待突变的DNA片段装载到克隆载体上，该载体上片段装载到克隆载体上，该载体上必须存在必须存在1个单一酶切位点。当这两个引物同时指导个单一酶切位点。当这两个引物同时指导DNA合成合成时，突变的时，突变的DNA链将不再含有该单一酶切位点，而模板链将不再含有该单一酶切位点，而模板DNA在在该位置能被切割。通过转化大肠杆菌，线性化的模板该位置能被切割。通过转化大肠杆菌，线性化的模板DNA不能不能复制，只有突变保持环状，可以获得转化子。复制，只有突变保持环状，可以获得转化子。四、四、PCR介导的定点诱变介导的定点诱变优点：优点：突变体回收率高；突变体回收率高；快速简便，不需制备单链快速简便，不需制备单链DNA模板；模板；高温的利用可降低模板高温的利用可降低模板DNA形成二级结构的几率；形成二级结构的几率；所有反应可在同一试管进行。所有反应可在同一试管进行。缺点：缺点：PCR扩增扩增DNA时会产生一定程度的碱基错配；时会产生一定程度的碱基错配；在扩增在扩增DNA的的3末端加上非预设碱基；末端加上非预设碱基；对每套引物和模板，对每套引物和模板，PCR反应的条件都需要优化；反应的条件都需要优化；标准标准PCR不能有效扩增大于不能有效扩增大于3kb的的DNA片段。片段。（一）大引物（一）大引物PCR诱变诱变（二）重叠延伸（二）重叠延伸PCR诱变诱变(overlappingextensionPCR)（三）重叠延伸剪接技术（三）重叠延伸剪接技术（splicingbyoverlapextension,SOE）（四）同源重组法（四）同源重组法（五）双向（五）双向PCR快速定点诱变快速定点诱变五、野生型五、野生型DNA的筛选和排除的筛选和排除限制性内切酶限制性内切酶DpnI可可特异性切割特异性切割dsDNA中的中的Gm6ATC位点，对半甲位点，对半甲基化的基化的DNA效率较低，效率较低，完全不能切割非甲基化完全不能切割非甲基化DNA。大肠杆菌体内。大肠杆菌体内DNA在在Dam甲基化酶催甲基化酶催化下完全甲基化，对化下完全甲基化，对DpnI敏感。敏感。第四节第四节 嵌套缺失嵌套缺失逐步从感兴趣的逐步从感兴趣的DNA的一端或两端删除多个寡核苷酸，的一端或两端删除多个寡核苷酸，得到一套终末端长短不同的嵌套缺失突变体，这个突得到一套终末端长短不同的嵌套缺失突变体，这个突变体群体也称变体群体也称渐次截短文库渐次截短文库。外切核酸酶外切核酸酶（35外切核酸酶活性）外切核酸酶活性）BAL31核酸酶核酸酶（35外切核酸酶活性）外切核酸酶活性）DNaseI（内切核酸酶活性）（内切核酸酶活性）一、外切核酸酶一、外切核酸酶的消化的消化二、二、BAL31核酸酶消化核酸酶消化主要活性为主要活性为3外切核酸酶活性，可从线性外切核酸酶活性，可从线性DNA两条链的两条链的3端去端去掉单核苷酸；掉单核苷酸；具有较弱的单链内切核酸酶活性；具有较弱的单链内切核酸酶活性；依赖依赖Ca2+EDTA可抑制其活性可抑制其活性三、三、DNaseI消化消化内切酶，可优先在嘧啶处水解内切酶，可优先在嘧啶处水解ds或或ssDNAMg2+：独立作用于每条：独立作用于每条DNA链，切点随机链，切点随机Mn2+：大致在同一位置切割：大致在同一位置切割dsDNA产生平端或产生平端或1-2个核苷酸突出个核苷酸突出