第七章第七章发酵过程中工艺参数的发酵过程中工艺参数的检测和控制检测和控制发酵涉及到微生物学、生物化学及发发酵涉及到微生物学、生物化学及发酵工艺学知识。要想获得高产，对消酵工艺学知识。要想获得高产，对消费菌的生活规律要充分了解。除了消费菌的生活规律要充分了解。除了消费阅历外，还需求科学的检测手段。费阅历外，还需求科学的检测手段。第第一节一节工业发酵的重要类型工业发酵的重要类型第二节第二节发酵过程的主要控制参数发酵过程的主要控制参数第三节第三节菌体及基质浓度对发酵的菌体及基质浓度对发酵的影响影响及控制及控制第四节第四节溶氧的浓度对发酵的影响及控制溶氧的浓度对发酵的影响及控制第五节第五节pH对发酵的影响及控制对发酵的影响及控制第七章第七章发酵工艺控制发酵工艺控制第六节第六节温度对发酵的影响及控制温度对发酵的影响及控制第七节第七节二氧化碳对发酵的影响及控制二氧化碳对发酵的影响及控制第八节第八节补料及泡沫对发酵的影响及控制补料及泡沫对发酵的影响及控制第九节第九节工业发酵染菌的防治工业发酵染菌的防治第十节第十节发酵终点的判别发酵终点的判别第一节第一节工业发酵的主要类型工业发酵的主要类型一、按投料方式分一、按投料方式分微生物培育有三种方式，分批、延续培育微生物培育有三种方式，分批、延续培育和分批补料。和分批补料。二、按菌体生长与产物构成关系分二、按菌体生长与产物构成关系分微生物发酵过程中的动力学类型微生物发酵过程中的动力学类型类型类型I、类型、类型II、类型、类型III第一节第一节工业发酵的主要类型工业发酵的主要类型分零售酵法分零售酵法(batchfermentation)分零售酵又称分批培育，发酵工分零售酵又称分批培育，发酵工业中常见的分零售酵方法是采用单罐业中常见的分零售酵方法是采用单罐深层分零售酵法。每一个分零售酵过深层分零售酵法。每一个分零售酵过程都阅历接种、生长繁衍、菌体衰老程都阅历接种、生长繁衍、菌体衰老进而终了发酵，最终提取出产物。进而终了发酵，最终提取出产物。第一节第一节工业发酵的主要类型工业发酵的主要类型二二延续发酵法延续发酵法(continuousfermentation)在发酵罐中一方面以一定速度延续不在发酵罐中一方面以一定速度延续不断地流加新颖液体培育基，另一方面又以断地流加新颖液体培育基，另一方面又以同样的速度延续不断地将发酵液排出，使同样的速度延续不断地将发酵液排出，使发酵罐中的菌体进展延续生长和发酵。发酵罐中的菌体进展延续生长和发酵。Flash1第一节第一节工业发酵的主要类型工业发酵的主要类型三三补料分零售酵法补料分零售酵法(fed-batchfermentation)补料分零售酵又称半延续发酵，是指补料分零售酵又称半延续发酵，是指在分零售酵过程中，间歇或延续地补加新在分零售酵过程中，间歇或延续地补加新颖培育基的培育方法。与传统分零售酵相颖培育基的培育方法。与传统分零售酵相比，其优点在于使发酵系统中维持很低的比，其优点在于使发酵系统中维持很低的基质浓度。基质浓度。第一节第一节工业发酵的主要类型工业发酵的主要类型二、按菌体生长与产物构成关系分二、按菌体生长与产物构成关系分微生物发酵过程中的动力学类型微生物发酵过程中的动力学类型类型类型I、类型、类型II、类型、类型III微生物发酵过程中的动力学类型微生物发酵过程中的动力学类型比比速速率率：是是1克克细细胞胞每每小小时时构构成成产产物物的的克克数数或或每每克克细细胞胞每每小小时时利利用用糖糖的的克克数数g/g.h或或每每克克细细胞胞每每小时繁衍细胞的克数。小时繁衍细胞的克数。类型类型I：菌体的生长、碳源的利用：菌体的生长、碳源的利用与产物构成的比速率曲线均有一个与产物构成的比速率曲线均有一个顶峰，且顶峰根本上在一样的时间顶峰，且顶峰根本上在一样的时间出现。如单细胞蛋白消费等。出现。如单细胞蛋白消费等。类型类型II：可粗略的分为两个节段，：可粗略的分为两个节段，在发酵的第一期菌体迅速生长，在发酵的第一期菌体迅速生长，产物构成很少或全无，在第二个产物构成很少或全无，在第二个阶段产物高速构成，菌体生长和阶段产物高速构成，菌体生长和糖耗也相应添加。如柠檬酸和某糖耗也相应添加。如柠檬酸和某些氨基酸发酵。些氨基酸发酵。类型类型III：生长和产物是来自两个代谢：生长和产物是来自两个代谢途径，而不是来自分解代谢途径，在途径，而不是来自分解代谢途径，在基质耗费和菌体生长之后，菌体利用基质耗费和菌体生长之后，菌体利用中间代谢反响来构成产物，也就是，中间代谢反响来构成产物，也就是，初级代谢和产物构成是完全分开的，初级代谢和产物构成是完全分开的，如许多抗生素发酵。如许多抗生素发酵。Flash2第第二节、二节、发酵过程的主要控制参数发酵过程的主要控制参数工厂设备越先进，产品附加值越高，检测的参数就越工厂设备越先进，产品附加值越高，检测的参数就越多。但工厂消费讲究越简单越好。发酵控制普通分为物理、多。但工厂消费讲究越简单越好。发酵控制普通分为物理、化学、生物三类。化学、生物三类。一、物理参数一、物理参数1温度：最适生长温度，它与酶反响速率，氧的溶解、温度：最适生长温度，它与酶反响速率，氧的溶解、产物合成都有关。产物合成都有关。如四环素消费菌在如四环素消费菌在30时合成金霉时合成金霉素，素，35时，只产生四环素，合成方向会改动。时，只产生四环素，合成方向会改动。生长生长温度与合成温度不同。如青霉素，生长温度与合成温度不同。如青霉素，生长30，合成，合成24.7。2压力压力Pa，帕斯卡。，帕斯卡。98070Pa=1Kg/cm21Mpa103Kpa=106Pa。灭菌压力灭菌压力1Kg/cm2=0.11Mpa。发酵罐压普通为发酵罐压普通为0.020.05Mpa。3搅拌转速搅拌转速r/min。罐体积罐体积转速转速r/min通风量通风量m3/m3.min50L5501：0.650000L1101：0.12普通来说，假设小罐与大罐的几何一样。但为什么转速会相普通来说，假设小罐与大罐的几何一样。但为什么转速会相差这么大？缘由大罐气液接触时间长，氧的溶解率高，搅拌差这么大？缘由大罐气液接触时间长，氧的溶解率高，搅拌和通气均可小些，和通气均可小些，一、物理参数一、物理参数4搅拌功率搅拌功率KWP/VKW/m3消费上：普通用瓦特计直接丈量电动机的消费上：普通用瓦特计直接丈量电动机的耗用功率，从中减去各项传动摩擦所损耗耗用功率，从中减去各项传动摩擦所损耗的功率。对小罐，误差较大。用电阻应变的功率。对小罐，误差较大。用电阻应变式动力计丈量。式动力计丈量。一、物理参数5通气量通气量V/V.min气体流量用转子流量计丈量。用气体流量用转子流量计丈量。用m3/m3.min，指每分钟每立方米发酵液通进，指每分钟每立方米发酵液通进1立方立方米空气，用米空气，用11表示。表示。如柠檬酸如柠檬酸10.15，而青霉素，而青霉素11。6粘度粘度Pas(秒秒Pa=1N/m2是细胞生长和细胞形状的一项标志，它是细胞生长和细胞形状的一项标志，它的大小可改动氧传送的阻力，又可表示的大小可改动氧传送的阻力，又可表示相对菌体的浓度。相对菌体的浓度。7浊度：反映单细胞生长情况浊度：反映单细胞生长情况的参数。如大肠杆菌，用光密度的参数。如大肠杆菌，用光密度650nm上检测或计数板计数。上检测或计数板计数。8料液流量料液流量L/min这这是控制流体进料的参数。是控制流体进料的参数。二、化学参数二、化学参数1PH：发酵过程中产酸或产碱的：发酵过程中产酸或产碱的生化反响的综合结果。细菌是多少生化反响的综合结果。细菌是多少？酵母、霉菌、放线菌？酵母、霉菌、放线菌？ 二、化学参数2基质浓度：指营养成分的浓度，基质浓度：指营养成分的浓度，发酵过程中必需定时测定复原糖，发酵过程中必需定时测定复原糖，总糖，磷酸盐、氮氨基酸或氨氮总糖，磷酸盐、氮氨基酸或氨氮等基质的浓度。等基质的浓度。 二、化学参数3溶解氧浓度：溶解氧浓度：mmol/L,mg/L,ppm或用或用%指饱和浓度的百分数指饱和浓度的百分数表示。利用它的变化可了解消费表示。利用它的变化可了解消费菌对氧利用的规律也能反映发酵的菌对氧利用的规律也能反映发酵的异常情况。科研上用于检测设备供异常情况。科研上用于检测设备供氧才干的目的。氧才干的目的。二、化学参数5产物的浓度：产物的浓度：ug/ml，消费中合，消费中合成期产物的浓度需求测定，如柠檬成期产物的浓度需求测定，如柠檬酸消费用酸消费用NaOH滴定，抗生素用抑滴定，抗生素用抑菌圈大小测定。菌圈大小测定。二、化学参数6废气中氧和二氧化碳的浓度：废气中氧和二氧化碳的浓度：用顺磁氧分析仪测定氧气的浓度，用顺磁氧分析仪测定氧气的浓度，用红外二氧化碳分析仪测定二氧化用红外二氧化碳分析仪测定二氧化碳浓度，如氧气减少和二氧化碳添碳浓度，如氧气减少和二氧化碳添加阐明是好氧代谢的结果。加阐明是好氧代谢的结果。三、生物参数1.菌丝形状：察看菌丝形状是消费菌丝形状：察看菌丝形状是消费中最常用的方法。每隔中最常用的方法。每隔8小时镜检，小时镜检，能及时发现异常染菌。如青霉素生能及时发现异常染菌。如青霉素生产，消费菌生长分为产，消费菌生长分为I.孢子发芽，孢子发芽，II.菌丝增殖，菌丝增殖，III.菌丝分枝旺盛，菌丝分枝旺盛，出现脂肪颗粒，出现脂肪颗粒，IV.菌丝生长减缓，菌丝生长减缓，细胞内出现小气泡，细胞内出现小气泡，V.气泡增大，气泡增大，颗粒消逝，产物构成，颗粒消逝，产物构成，VI.气泡延伸气泡延伸，菌丝自溶。，菌丝自溶。2.菌体浓度：测定方法有三种：菌体浓度：测定方法有三种：A.湿重法：量湿重法：量100ml发酵液，进展过滤，发酵液，进展过滤，滤后菌体用水洗净，然后用吸水纸将水分滤后菌体用水洗净，然后用吸水纸将水分挤干，直接称量。挤干，直接称量。B.干重法：上述步骤菌丝放干重法：上述步骤菌丝放85烘干烘干至恒重。至恒重。C.体积法：取样品体积法：取样品10ml放于刻度离心放于刻度离心管内，用转速为管内，用转速为3000转转/分别分别10min，计算计算%V/V。固体原料也在其中，。固体原料也在其中，但如培育基组成不变条件下，具有相但如培育基组成不变条件下，具有相对准确性。对准确性。第三节第三节菌体及基质浓度对发酵的影响及控制菌体及基质浓度对发酵的影响及控制3.1菌体浓度菌体浓度对对初初级级产产品品来来说说，菌菌浓浓愈愈大大，产产量量愈愈高高，但但菌菌浓浓符符合合生生长长曲曲线线。象象柠柠檬檬酸酸消消费费由由糖糖转转化成酸。化成酸。次次级级产产品品如如菌菌浓浓过过大大，由由于于代代谢谢产产物物的的积积累累，会会影影响响产产量量。因因其其产产品品与与原原料料并并非非对对应应或底物抑制，分介产物抑制等。或底物抑制，分介产物抑制等。C源，青霉素消费中葡萄糖和源，青霉素消费中葡萄糖和乳糖利用。因此工业上培育基中乳糖利用。因此工业上培育基中含有迅速和缓慢利用的混合含有迅速和缓慢利用的混合C源。源。如为聚合物，利用缓慢。如为聚合物，利用缓慢。3.2基质浓度基质浓度N源，也有迅速利用和缓慢利用，源，也有迅速利用和缓慢利用，前者有氨基酸、硫酸铵、尿素和玉前者有氨基酸、硫酸铵、尿素和玉米浆，后者有黄豆饼粉、花生、棉米浆，后者有黄豆饼粉、花生、棉子饼粉等蛋白质。前者菌生长快，子饼粉等蛋白质。前者菌生长快，但产量低，选用快、慢混合氮源很但产量低，选用快、慢混合氮源很重要。消费上可补加有机或无机氮重要。消费上可补加有机或无机氮源。源。3.2基质浓度基质浓度磷磷酸酸盐盐：P是是核核酸酸，许许多多辅辅酶酶，ATP，组组成成部分，部分，P对微生物生长、代谢有重要作用。对微生物生长、代谢有重要作用。工工业业多多以以供供应应KH2PO4、K2HPO4为为磷磷源源，配配料料时时，KH2PO4计计算算，每每克克KH2PO4实实际际磷磷含含量量227毫毫克克，如如将将其其溶溶在在1L水水中中，就就是是227ppm。用用链链霉霉菌菌消消费费四四环环素素时时，菌菌体体生生长长最适磷为最适磷为65-70ppm，合成为，合成为25-30ppm。测测定定方方法法：磷磷与与钼钼酸酸铵铵NH42M0O4作作用用，生生成成磷磷钼钼酸酸铵铵，在在酸酸性性条条件件下下，用用VC复复原原，生成钼蓝，然后比色。生成钼蓝，然后比色。 3.3基质浓度的控制分分批批补补料料培培育育fed-batch culture,简简称称FBC，是是指指在在分分批批培培育育过过程程中中，间间歇歇和和延延续续地地补补加加一一种种或或多多种种成成分分的的新新颖颖培培育育基基的的培培育育方方法法。有有报报道道四四环环素素发发酵酵不不补补料料的的话话，培培育育72-96h，发发酵酵单单位位5500-7000单单位位/mL，而而补补糖糖的的批批号号，发发酵酵周周期期延延伸伸到到120-130h，单位提高到，单位提高到10000-12000u/ml。防止一次投料，菌丝生长过盛。防止一次投料，菌丝生长过盛。延伸次级代谢产物的分泌期，延伸次级代谢产物的分泌期，提高产量。提高产量。v中间补料的机理中间补料的机理vFBC的内容的内容补补碳碳源源、氮氮源源无无机机和和有有机机，如如蛋白胨、玉米浆、硫酸铵、尿素。蛋白胨、玉米浆、硫酸铵、尿素。无机盐，微量元素，前体和促进剂。无机盐，微量元素，前体和促进剂。补补全全料料和和补补水水，总总之之视视情情况况不不同同，补单项还是全部。补单项还是全部。v补料的时间和方式补料的时间和方式补补料料的的时时间间很很重重要要，有有人人研研讨讨加加糖糖时时间间对对四四环环素素发发酵酵单单位的影响。位的影响。接种接种20h45h62h产量产量6000u/ml10000u/ml5000u/ml普普通通以以为为，过过早早补补糖糖，能能够够刺刺激激菌菌丝丝生生成成，加加速速糖糖的的利利用用，过过迟迟补补糖糖，能能够够菌菌丝丝的的内内在在质质量量已已遭遭到到一一定定损损害害，补糖只是干扰代谢并不能提高产量。补糖只是干扰代谢并不能提高产量。v补料的时间和方式补料的时间和方式补料的方式：补料的方式：小量间隙多次补入。小量间隙多次补入。小量延续滴加补入。小量延续滴加补入。大大量量多多次次补补入入或或大大量量少少次次补补入入等。等。补料的实例补料的实例:如庆大霉素消费，大罐如庆大霉素消费，大罐总体积总体积20吨，第一次装料吨，第一次装料7吨，接种吨，接种后后15h一次性补一次性补5吨，然后在吨，然后在30-60h中中小量间隙多次补入小量间隙多次补入6吨料全料，吨料全料，视生长情况决议能否在视生长情况决议能否在80h补适量水。补适量水。总周期总周期120-130h。一、溶氧的浓度对发酵的影响一、溶氧的浓度对发酵的影响微生物对氧的需求：微生物对氧的需求：1、C6H12O6+6O26CO2+6H2O+能量能量从分子式看出，从分子式看出，180g葡萄糖完全氧化需葡萄糖完全氧化需190克克O2。2、构成细胞成分含有氧，如酵母细胞元素组成、构成细胞成分含有氧，如酵母细胞元素组成为为C3.95N6.5O1.94。第四节第四节溶氧的浓度对发酵的影响及控制溶氧的浓度对发酵的影响及控制O2在在水水中中的的溶溶解解度度很很低低。如如在在25，1个个大大气气压压下下O2溶溶解解在在水水中中的的量量为为0.2mmol/L，或或6.4mg/L。而而微微生生物物需需氧氧量量2050mmol/L.h，正正常常情情况况下下，只能维持只能维持2050秒钟秒钟,水中氧耗费完。水中氧耗费完。怎怎样样供供氧氧呢呢？用用纯纯O2输输入入发发酵酵罐罐，效效果果好好，但但O2在在水水中中的的溶溶解解度度较较低低，大大多多跑跑了了，本本钱钱高高，没没有适用价值。有适用价值。前往根本概念：根本概念：1、微生物摄氧率、微生物摄氧率mmolO2/L单位体积培育液每小时耗费的氧量。单位体积培育液每小时耗费的氧量。、呼吸强度、呼吸强度o2mmolo2/g干菌体干菌体.h单位分量的干菌体每小时耗费的氧量。单位分量的干菌体每小时耗费的氧量。两者关系两者关系=Qo2.XX发酵液中菌体密度发酵液中菌体密度g/L。临界氧浓度临界氧浓度3.临界氧浓度：临界氧浓度：微生物对发酵液中溶解氧浓度有一个微生物对发酵液中溶解氧浓度有一个最低要求，这个浓度叫临界氧浓度。最低要求，这个浓度叫临界氧浓度。临界氧浓度临界氧浓度不同微生物不同微生物C临界不同，见下表：临界不同，见下表：菌种菌种温度温度.C临界临界mg/L大肠杆菌大肠杆菌37.80.26酵母菌酵母菌34.80.15产黄青霉产黄青霉240.7阐明青霉菌摄氧率高，发酵时空气通气量大。阐明青霉菌摄氧率高，发酵时空气通气量大。同一种菌生长不同阶段同一种菌生长不同阶段C临界不同。临界不同。如幼龄菌大于老龄菌如幼龄菌大于老龄菌另外普通消费菌都是：另外普通消费菌都是：生长期大于合成期的临界氧浓度。生长期大于合成期的临界氧浓度。二、氧在液体中的溶解特性二、氧在液体中的溶解特性饱饱和和浓浓度度：气气体体与与液液体体相相接接触触，气气体体分分子子就就会会溶溶解解于于液液体体之之中中。经经过过一一段段时时间间的的接接触触，气气体体分分子子在在气气液液两两相相中的浓度就会到达动态平衡。中的浓度就会到达动态平衡。溶溶解解氧氧的的饱饱和和浓浓度度C*的的单单位位可可用用mmolo2/L、ppm、和、和mgo2/L。影响氧饱和浓度的主要要素有：影响氧饱和浓度的主要要素有：二、氧在液体中的溶解特性二、氧在液体中的溶解特性一一温温度度：工工业业产产品品大大多多是是随随着着温温度度升升高高，溶溶解解度度添添加加，；利利用用这这个个特特点点得得到到晶晶体体。如如柠柠檬檬酸酸、葡葡萄萄糖糖等等。而而O2正正相相反反，温温度度添加，添加，C降低。降低。温度温度035溶解度溶解度mmolo2/L2.181.09纯氧纯氧二二溶溶液液的的性性质质：氧氧在在不不同同性性质质的的溶溶液液中的溶解度是不同的。中的溶解度是不同的。同同一一种种溶溶液液由由于于其其中中溶溶质质含含量量不不同同，氧氧的的溶解度也不同。溶解度也不同。盐盐酸酸0.5mol1mol2mol1.21 1.16 1.12溶质含量越高，氧的溶解度就越小。溶质含量越高，氧的溶解度就越小。氧在液体中的溶解特性三氧分压；三氧分压；亨利公式：亨利公式：C*=H-1Po2C*在平衡形状下液体中氧的溶解度在平衡形状下液体中氧的溶解度mmolo2/LPo2氧分压氧分压MPaH亨利常数亨利常数MPaL/mmolo2从公式中可知从公式中可知C*与与Po2成正比。气相中氧的成正比。气相中氧的浓度取决大气压和浓度取决大气压和纯氧；纯氧；罐压提高，罐压提高，Po2提高。提高。C*增大，但不能太高，纯氧也可提高。增大，但不能太高，纯氧也可提高。利用吸氮安装，减少空气中的氮气，添加利用吸氮安装，减少空气中的氮气，添加氧含量。氧含量。实际上，发酵过程中：实际上，发酵过程中：温度越低，温度越低，C*越高，越高，溶质越稀，溶质越稀，C*越高，越高，罐压越高，罐压越高，C*越大。越大。但工业上运用都遭到限制。但工业上运用都遭到限制。三、三、氧在溶液中的传送氧在溶液中的传送 N=KLaC*CL)式中式中N氧的传送速率，氧的传送速率，mmolO2/h；C*溶液中饱和溶氧浓度，溶液中饱和溶氧浓度，mmolO2L；CL溶液主流中的溶氧浓度，溶液主流中的溶氧浓度，mmolO2L；KLa以浓度差为推进力的氧传质以浓度差为推进力的氧传质系数，系数，1h；a比外表积单位体积溶液中所比外表积单位体积溶液中所含有的气液接触面积含有的气液接触面积m2m3。由。由于于a很难测定，所以将很难测定，所以将L当成一项，称当成一项，称为液相体积氧传送系数，为液相体积氧传送系数，1h四、氧的传送方程式四、氧的传送方程式N=KLaC*CL)双膜实际：双膜实际：是气体吸收的根本实际：是气体吸收的根本实际：P空气中的分压；空气中的分压；Pi界面处氧分压；界面处氧分压；PPi称为推进力气相称为推进力气相Ci界面处氧的浓度；界面处氧的浓度；CL液相中氧的浓度；液相中氧的浓度；CiCL为液相推进力。为液相推进力。在稳定传质过程中经过双膜的传氧速率在稳定传质过程中经过双膜的传氧速率N应相等。应相等。N=KGaPPi=KLaCiCL由于由于Pi和和Ci无法丈量，因此改为无法丈量，因此改为N=KGaPP*=KLaC*CLN=KLaC*CL)五、影响供氧的要素五、影响供氧的要素氧的传送速率氧的传送速率N=KLaC*-CL影响氧传送推进力的要素：影响氧传送推进力的要素：C*-CL1提高提高C*，要素有温度、溶液、氧分压，三点都，要素有温度、溶液、氧分压，三点都有局限性。在抗生素消费中有时需求补水，原理有局限性。在抗生素消费中有时需求补水，原理使溶液稀释，使溶液稀释，C*提高。提高。2降低发酵液中的降低发酵液中的CL如降低通气量和搅拌速度可降低如降低通气量和搅拌速度可降低CL，但发酵过，但发酵过程中发酵液的程中发酵液的CL不能低于不能低于C临界，否那么就会影临界，否那么就会影响微生物的呼吸。响微生物的呼吸。影响影响KLa的要素的要素经过长时间的研讨和消费实际证经过长时间的研讨和消费实际证明，影响发酵设备的明，影响发酵设备的KLa。主要要素。主要要素有搅拌效率、空气流速、发酵液的物有搅拌效率、空气流速、发酵液的物理化学性质、泡沫形状、空气分布器理化学性质、泡沫形状、空气分布器外形和发酵罐的构造等。外形和发酵罐的构造等。 一搅拌功率对 KLa的影响1搅拌的作用搅拌的作用A.把大气泡打碎，添加气液两相的接触面积，把大气泡打碎，添加气液两相的接触面积，KLa添加；添加；B.降低液膜厚度，降低液膜厚度，KLa添加；添加；C.减少菌丝结团，减少菌周围液膜阻力，并减少菌丝结团，减少菌周围液膜阻力，并有利于排出废气；有利于排出废气；啤酒酵母培育啤酒酵母培育搅拌速度搅拌速度(rmin)KLa摄氧率摄氧率30040576500169720700216864二空气流速二空气流速KLa与空气流速与空气流速V有关。有关。V添加添加KLa添加。但当添加。但当V添加到一定值后添加到一定值后KLa便不添加，因存在所谓气泛景象，即便不添加，因存在所谓气泛景象，即空气流速过大时，气流构成大气泡在空气流速过大时，气流构成大气泡在轴的周围逸出。轴的周围逸出。 螺旋桨式搅拌器 圆盘平直叶涡轮搅拌器三发酵液理化性质的影响。三发酵液理化性质的影响。KLa与粘度成反比。在发酵过程中，由于粘度变化，而使发酵液呈多种流与粘度成反比。在发酵过程中，由于粘度变化，而使发酵液呈多种流变学性质液体的湍动性和液膜的阻力。变学性质液体的湍动性和液膜的阻力。普通细菌、酵母发酵液粘度为一常数。普通细菌、酵母发酵液粘度为一常数。放线菌、霉菌粘度不是一个常数。放线菌、霉菌粘度不是一个常数。n复膜氧电极的原理复膜氧电极的原理n溶氧电极可以看作是一种电解电池，它有两只具有不溶氧电极可以看作是一种电解电池，它有两只具有不同电性的电极，一只是银丝做成的阴极，另一只是铅皮卷同电性的电极，一只是银丝做成的阴极，另一只是铅皮卷成的阳极。这对电极安装在两端开口的细的玻璃套管内，成的阳极。这对电极安装在两端开口的细的玻璃套管内，在接近阴极的一端用一种耐热的、只允许气体透过而不透在接近阴极的一端用一种耐热的、只允许气体透过而不透过水及离子的半浸透塑料膜覆盖，构成一个有一定容积的过水及离子的半浸透塑料膜覆盖，构成一个有一定容积的电池，在电池中参与数毫升的电解质溶液电池，在电池中参与数毫升的电解质溶液5molHAC0.5molNaAC十十0.1molPbAC2。这就在两极之间产。这就在两极之间产生了一个电位，使阳极的铅变成铅离子生了一个电位，使阳极的铅变成铅离子Pb+进入电解质进入电解质溶液，同时放出的电子在阴极上把透过半透膜进入电池的溶液，同时放出的电子在阴极上把透过半透膜进入电池的氧立刻复原成氧立刻复原成OH见图见图六、液相中氧的浓度的测定六、液相中氧的浓度的测定阳极的反响：阳极的反响：PbPb+2e阴极的反响：阴极的反响：2e+1/2O2+H2O2OH- 复膜氧电极操作：在实罐灭菌时将电极复膜氧电极操作：在实罐灭菌时将电极装入，灭菌后电流表指示为最低值，这装入，灭菌后电流表指示为最低值，这时通气保压、搅拌、降温，溶氧时通气保压、搅拌、降温，溶氧CL会到会到达最大值，电流表指示为达最大值，电流表指示为100%。普通在。普通在抗生素消费时，接种后抗生素消费时，接种后11个小时电流值个小时电流值坚持一定，坚持一定，12小时后开场下降，小时后开场下降，43小时小时为最低值，随后电流值便上升。为最低值，随后电流值便上升。7.2发酵过程中溶氧的变化。发酵过程中溶氧的变化。培培育育基基灭灭菌菌后后，通通入入无无菌菌空空气气，降降温温后后培培育育基基中中的的溶溶解解氧氧到到达达，普普通通发发酵酵前前期期随随着着微微生生物物摄摄氧氧率率的的不不断断上上升升，溶溶氧氧量量出出现现一一个个。经经过过一一段段时时间间平平稳稳期后，便随之期后，便随之。前往7.3溶氧的控制溶氧的控制菌的生长所需求的氧应略高于临界值。菌的生长所需求的氧应略高于临界值。控制溶氧浓度的方法有控制溶氧浓度的方法有:1.搅拌转速搅拌转速2.进气量进气量3.适当降温、补水和加泡敌来改善溶氧程度。适当降温、补水和加泡敌来改善溶氧程度。第五节、第五节、pH对发酵的影响及其控制对发酵的影响及其控制5.1pH值对菌生长和代谢产物构成的影响。值对菌生长和代谢产物构成的影响。不同菌生长不同菌生长pH值不同值不同改改动动发发酵酵方方向向黑黑曲曲霉霉pH2-3时时产产柠柠檬檬酸酸，pH7时生成草酸。时生成草酸。生生长长和和合合成成pH不不同同如如链链霉霉素素产产生生菌菌生生长长的的最最适适pH为为6.3-6.9，而合成，而合成pH6.7-7.3。改动菌膜电荷。改动菌膜电荷。直接影响酶的活性。直接影响酶的活性。影响培育基中营养物质和中间代谢产物的介离。影响培育基中营养物质和中间代谢产物的介离。该物质都在水中解离，氢离子浓度对这些物质该物质都在水中解离，氢离子浓度对这些物质的解离影响很大，从而影响微生物的营养吸收、的解离影响很大，从而影响微生物的营养吸收、酶的活性等。酶的活性等。pH影响菌生长的机理？影响菌生长的机理？1调调理理发发酵酵过过程程中中由由于于营营养养物物质质的的分分解解，菌菌的的代代谢谢等等，pH值值会会发发生生变变化化。调调理理的的方方法有：法有：H2SO4和和NaOH直接控制直接控制用用补补硫硫酸酸铵铵和和氨氨水水控控制制PH较较高高时时补补加加硫硫酸铵。当酸铵。当pH较低时补加氨水。较低时补加氨水。可以经过补加糖或油来调理可以经过补加糖或油来调理pH2控控制制最最适适pH在在微微生生物物生生长长和和产产物物构构成成的的关关系系中中有有四种情况。四种情况。比生长速率比生长速率u和产物比消费和产物比消费速率速率Qp最适最适pH范围较宽，范围较宽，消费较易控制。消费较易控制。u、Qp二者一个较宽，一个二者一个较宽，一个较窄。较窄。二者都较窄，二者都较窄，pH又一样。又一样。二者都较窄，二者都较窄，pH又不同。又不同。在发酵过程中，产热的要素有生物热在发酵过程中，产热的要素有生物热(Q生物生物)和搅拌热和搅拌热(Q搅拌搅拌)；散热要素有蒸发热；散热要素有蒸发热(Q蒸发蒸发)、辐射热、辐射热(Q辐射辐射)。产生的热能减去散失的。产生的热能减去散失的热能，所得的净热量就是发酵热热能，所得的净热量就是发酵热Q发酵，发酵，kJ(m3.h)，即即Q发酵发酵=Q生物生物+Q搅拌搅拌-Q蒸发蒸发-Q辐射。辐射。第六节第六节温度对发酵的影响与控制温度对发酵的影响与控制第六节 温度对发酵的影响与控制6.1发发酵酵热热发发酵酵过过程程中中产产生生的的热热能能减减去去散散失的热能，所得的净热量就是发酵热。失的热能，所得的净热量就是发酵热。生物热生物热Q生物生物C6H12O6+12O66CO+6H2O+热热量量，除除了了用用于于合合成成外外，其其他他部部分分那那么么以以热热的的方方式式分分发发出出来来。对对数数生生长长期期产产热热量量多多。热热量量的的单位单位KJ/m3.h)第六节 温度对发酵的影响与控制搅搅拌拌热热Q搅搅拌拌液液体体与与搅搅拌拌设设备备之之间间的的摩擦产生的热量。摩擦产生的热量。Q搅拌搅拌=P/V3600。KW/m3KJ/Kw.h3600为热功当量。为热功当量。蒸发热蒸发热Q Q蒸发蒸发 通气时，引起通气时，引起发酵液水分的蒸发被冷空气和蒸发发酵液水分的蒸发被冷空气和蒸发水分带走的热量叫蒸发热。水分带走的热量叫蒸发热。辐射热辐射热Q辐射辐射因发酵液温度与罐外因发酵液温度与罐外温度不同，发酵液中有部分热经过罐体向温度不同，发酵液中有部分热经过罐体向外辐射。外辐射。由于由于Q生物及生物及Q蒸发在发酵过程中是随着蒸发在发酵过程中是随着时间变化的，因此发酵热在整个过程中也时间变化的，因此发酵热在整个过程中也随时间变化，发酵罐操作也需求降温、加随时间变化，发酵罐操作也需求降温、加温控制。温控制。 经经过过丈丈量量一一定定时时间间内内冷冷却却水水的的流流量量和和冷冷却却水水进进出出口温度，用下式计算：口温度，用下式计算：Q发酵发酵=G.ct1-t2/V单位单位千卡千卡/m3.hG冷冷却却水水c水水的的比比热热t1、t2进进出出的的冷冷却却水水温度温度。V发酵液体积发酵液体积m3普普通通抗抗生生素素发发酵酵过过程程中中的的最最大大发发酵酵热热均均为为3000-5000千卡千卡/立方米立方米.小时。小时。6.2发酵热的测定及计算发酵热的测定及计算抗生素消费，菌的生长和合成需不同抗生素消费，菌的生长和合成需不同温度。有人实验青霉素变温发酵，起初温度。有人实验青霉素变温发酵，起初5小时，维持在小时，维持在30，以后降到，以后降到25培育培育35h，再降到，再降到20培育培育85h，最后又提高，最后又提高到到25，培育，培育40小时，放罐。青霉素产小时，放罐。青霉素产量比在量比在25恒温培育提高恒温培育提高14.7%。因此。因此生长的温度和合成的温度并不一致。生长的温度和合成的温度并不一致。6.3控制温度的运用控制温度的运用CO2的来源和影响的来源和影响CO2浓度高对微生物生长不利。浓度高对微生物生长不利。1.当当细细胞胞膜膜的的脂脂质质相相中中的的CO2浓浓度度偏偏高高，细胞膜运输遭到妨碍，生长遭到抑制细胞膜运输遭到妨碍，生长遭到抑制2.使使发发酵酵液液pH降降低低，影影响响菌菌生生长长和和产产物物合合成。成。 第七节 CO2的影响及其控制但某些菌又需求适量的但某些菌又需求适量的CO2。栽培金针菇菌。栽培金针菇菌最明显。动物细胞培育需求最明显。动物细胞培育需求CO2培育箱培育箱。CO2能合成某些小分子前体物质如能合成某些小分子前体物质如:丙酮酸丙酮酸+CO2+ATP草酰乙酸草酰乙酸+ADP+Pi。再如脂肪酸生物合成也需，如乙酰再如脂肪酸生物合成也需，如乙酰CoA+CO2丙二酰丙二酰CoA长链脂肪酸。长链脂肪酸。8.1泡泡沫沫的的性性质质：泡泡沫沫是是气气体体分分散散在在液液体体中中的的一一种种胶胶体体系系统统，气气泡泡间间被被一一层层液液膜膜隔隔开开而而彼此不相连通。彼此不相连通。8.2泡沫的危害：泡沫的危害：呵斥大量的逃液，而使装料系数减少。呵斥大量的逃液，而使装料系数减少。泡沫从轴封中渗出，添加染菌时机。泡沫从轴封中渗出，添加染菌时机。妨碍菌的呼吸和生长，使产量下降。妨碍菌的呼吸和生长，使产量下降。 第八节、泡沫的影响及其控制8.3泡沫产生的要素：泡沫产生的要素：与高速搅拌及大空气流量有关，发酵时与高速搅拌及大空气流量有关，发酵时前期要留意空气流量，先小后逐渐加大前期要留意空气流量，先小后逐渐加大培育基成份有关：蛋白胨、玉米浆、黄培育基成份有关：蛋白胨、玉米浆、黄豆饼粉等，高蛋白，易起泡。豆饼粉等，高蛋白，易起泡。菌种不同，如有的生长慢，易起泡。菌种不同，如有的生长慢，易起泡。8.4泡沫的消除：泡沫的消除：机械消沫：在罐内装消沫浆。但作用不大。机械消沫：在罐内装消沫浆。但作用不大。化学消沫：化学消沫：A.消消泡泡剂剂有有天天然然油油，豆豆油油，菜菜子子油油等等，它它还还作作为为碳源被菌利用。碳源被菌利用。B.高高分分子子物物质质如如聚聚氧氧乙乙烯烯氧氧丙丙烯烯甘甘油油，GPE又又叫叫泡泡敌敌。消消泡泡才才干干比比植植物物油油60-80倍倍强强。目目前前工业上已取代油。工业上已取代油。8.5消泡的原理：消泡的原理：.泡沫外表层存在着极性的外表活性物质，泡沫外表层存在着极性的外表活性物质，而构成双电层时，可参与另一种有相反电而构成双电层时，可参与另一种有相反电荷的外表活性剂，可降低其机械强度，促荷的外表活性剂，可降低其机械强度，促使其破裂。使其破裂。.泡沫外表粘度较大时，可参与某些分泡沫外表粘度较大时，可参与某些分子内聚力较小的物质，以降低其外表粘度子内聚力较小的物质，以降低其外表粘度而使其破裂。而使其破裂。一减少泡沫构成的时机。一减少泡沫构成的时机。原料配比。原料配比。补料：如根底料被抽出一补料：如根底料被抽出一部分蛋白质原料，在菌丝长浓后再参与。部分蛋白质原料，在菌丝长浓后再参与。灭菌前加灭菌前加.二消除已构成的泡沫。二消除已构成的泡沫。起泡时加。加量普通为培育基总体积的起泡时加。加量普通为培育基总体积的0.02%-0.002%。多加对菌生长不利。多加对菌生长不利。8.6控制泡沫的方法控制泡沫的方法第九节发酵消费染菌及其防治第九节发酵消费染菌及其防治所谓发酵染菌是指在发酵过程中，消费所谓发酵染菌是指在发酵过程中，消费菌以外的其他微生物侵入了发酵系统，菌以外的其他微生物侵入了发酵系统，从而呵斥消费损失。从而呵斥消费损失。据报道，国内的青霉素发酵染菌率据报道，国内的青霉素发酵染菌率2，链霉素、红霉素和四环素发酵染菌率链霉素、红霉素和四环素发酵染菌率5，谷氨酸发酵噬菌体感染率谷氨酸发酵噬菌体感染率12。染。染菌对发酵消费率、提取率、得率、产质菌对发酵消费率、提取率、得率、产质量量和三废治理等都有很大的影响。量量和三废治理等都有很大的影响。耗费营养成分；耗费营养成分；分泌某些使抗生素失去活性的物质，如分泌某些使抗生素失去活性的物质，如青霉素酶能分解青霉素；青霉素酶能分解青霉素；分泌代谢产物改动发酵液的分泌代谢产物改动发酵液的pHpH值，抑制值，抑制菌种的消费和产物的合成；菌种的消费和产物的合成；添加发酵液的粘度呵斥过滤困难和提获添加发酵液的粘度呵斥过滤困难和提获得率下降；得率下降；一、杂菌的危害一、杂菌的危害二、杂菌的检测二、杂菌的检测1 1显微镜检查显微镜检查2 2无菌实验法无菌实验法3 3试剂盒检验法试剂盒检验法三、染菌发生的不同时间对发酵的影响及处置三、染菌发生的不同时间对发酵的影响及处置种子培育期染菌种子培育主要是种子培育期染菌种子培育主要是使消费菌生长与繁衍，此时，微生物菌使消费菌生长与繁衍，此时，微生物菌体浓度低，培育基的营养非常丰富，比体浓度低，培育基的营养非常丰富，比较容易染菌。假设将污染的种子带入发较容易染菌。假设将污染的种子带入发酵罐，那么危害极大，因此应严厉控制酵罐，那么危害极大，因此应严厉控制种子染菌的发生。一旦发现种子遭到杂种子染菌的发生。一旦发现种子遭到杂菌的污染，应经灭菌后弃去，并对种子菌的污染，应经灭菌后弃去，并对种子罐、管道等进展仔细检查和彻底灭菌。罐、管道等进展仔细检查和彻底灭菌。发酵前期染菌在发酵前期，微生发酵前期染菌在发酵前期，微生物菌体主要是处于生长、繁衍阶段，此物菌体主要是处于生长、繁衍阶段，此时期代谢的产物很少，相对而言这个时时期代谢的产物很少，相对而言这个时期也容易染菌，染菌后的杂菌将迅速繁期也容易染菌，染菌后的杂菌将迅速繁衍，与消费菌争夺培育基中的营养物质，衍，与消费菌争夺培育基中的营养物质，严重干扰消费菌的正常生长、繁衍及产严重干扰消费菌的正常生长、繁衍及产物的生成。可重新灭菌，重新接种物的生成。可重新灭菌，重新接种发酵中期染菌发酵中期染菌将会发酵中期染菌发酵中期染菌将会导致培育基中的营养物质大量耗费，并导致培育基中的营养物质大量耗费，并严重干扰消费菌的代谢，影响产物的生严重干扰消费菌的代谢，影响产物的生成。从目前的情况来看，发酵中期染菌成。从目前的情况来看，发酵中期染菌普通较难挽救，危害性较大，在消费过普通较难挽救，危害性较大，在消费过程中应尽力做到早发现，快处置。程中应尽力做到早发现，快处置。发酵后期染菌由于在发酵后期，培发酵后期染菌由于在发酵后期，培育基中的糖等营养物质已接近耗尽，且育基中的糖等营养物质已接近耗尽，且发酵的产物也已积累较多，假设染菌量发酵的产物也已积累较多，假设染菌量不太多，对发酵影响相对来说就要小一不太多，对发酵影响相对来说就要小一些，可继续进展发酵，或提早放罐。些，可继续进展发酵，或提早放罐。四、发酵染菌缘由分析四、发酵染菌缘由分析染菌的杂菌种类分析染菌的杂菌种类分析假设污染的杂菌是耐热的芽孢杆菌，能够假设污染的杂菌是耐热的芽孢杆菌，能够是由于培育基或设备灭菌不彻底、设备存是由于培育基或设备灭菌不彻底、设备存在死角等引起；在死角等引起；假设污染的是球菌等不耐热杂菌，能够是假设污染的是球菌等不耐热杂菌，能够是由于种子带菌、空气过滤效率低、设备渗由于种子带菌、空气过滤效率低、设备渗漏和操作问题等引起；漏和操作问题等引起；发酵染菌的规模分析发酵染菌的规模分析大批量发酵罐染菌空气过滤器介质失大批量发酵罐染菌空气过滤器介质失效等问题；效等问题；部分发酵罐染菌连消系统灭菌不彻底；部分发酵罐染菌连消系统灭菌不彻底；也能够是中间补料染菌，也能够是中间补料染菌，个别发酵罐延续染菌个别发酵罐延续染菌大都是由于设备大都是由于设备渗漏呵斥。渗漏呵斥。第十节、发酵终点的判别第十节、发酵终点的判别一一经经济济要要素素：降降低低本本钱钱，延延伸伸时时间间虽虽可可略略为为提提高高单单位位。但但占占罐罐，费电。费电。二二产产质质量量量量要要素素：放放罐罐过过早早，糖糖、氮氮残残留留较较多多，过过晚晚，菌菌丝丝自自溶溶，发酵液发粘，影响过滤。发酵液发粘，影响过滤。第十节、发酵终点的判别第十节、发酵终点的判别三、确定放罐的目的有：三、确定放罐的目的有：1产物产量高；产物产量高；2残糖量低；残糖量低；3菌菌体体开开场场自自溶溶，表表现现发发酵酵液液过过滤滤速速度度慢慢、氨氨基基酸酸含含量量、pH升升高高，和和菌菌丝丝形形状状如如碎片增多等。碎片增多等。Flash3Flash4Flash5思索题Flash6思索题Flash7思索题Flash8思索题Flash10思索题Flash9七、七、溶氧对发酵的影响及控制溶氧对发酵的影响及控制7.1溶氧的影响：溶氧的影响：初初级级代代谢谢产产物物，如如氨氨基基酸酸发发酵酵，与与需需氧氧量量亲亲密密相关。相关。A.供供氧氧充充足足，产产量量才才最最大大，反反之之遭遭到到剧剧烈烈的的抑抑制制。如谷氨酸发酵如谷氨酸发酵.B.供供氧氧充充足足，产产量量最最大大，但但限限氧氧，产产量量影影响响不不明明显。如赖氨酸发酵。显。如赖氨酸发酵。C.供供氧氧充充足足，产产量量受受限限制制，而而限限氧氧产产物物最最大大。如如亮氨酸发酵。亮氨酸发酵。次级代谢也同样。次级代谢也同样。供养充足供养充足限氧限氧举例举例A.产量大产量大抑制抑制谷氨酸谷氨酸B.产量大产量大影响不大影响不大赖氨酸赖氨酸C.产量抑制产量抑制大大亮氨酸、苯丙氨酸亮氨酸、苯丙氨酸阐明需氧发酵并不是溶氧愈大愈好。为什么会这样呢？阐明需氧发酵并不是溶氧愈大愈好。为什么会这样呢？这与氨基酸的生物合成途径有关。亮氨酸类合成并不经这与氨基酸的生物合成途径有关。亮氨酸类合成并不经过三羟酸循环，因此供氧过量，反而起到抑制造用过三羟酸循环，因此供氧过量，反而起到抑制造用酵母菌的固定化酵母菌的固定化1.每组每组40ml2.5%海藻酸钠加海藻酸钠加4克克上述酵母泥，搅拌均匀。酵母粉充上述酵母泥，搅拌均匀。酵母粉充分溶解。分溶解。2.将上述凝胶装入注射器中，滴入将上述凝胶装入注射器中，滴入0.2mol/L氯化钙中，控制滴速，氯化钙中，控制滴速，用玻棒搅拌成珠。用玻棒搅拌成珠。3.用无离子水洗涤后备用。用无离子水洗涤后备用。玉米淀粉培育基预备 20克玉米淀粉，加克玉米淀粉，加200毫升水，搅毫升水，搅拌加热到淀粉透明，加高温淀粉酶拌加热到淀粉透明，加高温淀粉酶4ML，90保温保温2小时，碘反响显小时，碘反响显棕色。棕色。糖化酶糖化酶4ML，60保温保温1-2小时，小时，糖化完全后，加热至沸，过滤，蛋糖化完全后，加热至沸，过滤，蛋白胨白胨5克，用糖量器测糖度，要求克，用糖量器测糖度，要求含糖量含糖量15%以上，灭菌备用。以上，灭菌备用。固定化酵母的活化 在装有在装有200mL活化糖液的活化糖液的500mL三角瓶中，参与上述固定化酵母三角瓶中，参与上述固定化酵母参与前用无菌水冲洗，摇匀后用参与前用无菌水冲洗，摇匀后用八层纱布封好瓶囗，放入八层纱布封好瓶囗，放入30的恒的恒温培育箱或摇瓶机中培育。培育过温培育箱或摇瓶机中培育。培育过程中，检测残糖锤度，并记录。程中，检测残糖锤度，并记录。酒精度的测定酒精度的测定准确量取准确量取100mL发酵成熟醪倒入发酵成熟醪倒入500mL蒸蒸馏瓶中，并参与等量的蒸馏水。蒸馏瓶用馏瓶中，并参与等量的蒸馏水。蒸馏瓶用插有温度计的胶塞塞紧，衔接好冷凝管，插有温度计的胶塞塞紧，衔接好冷凝管，勿使漏气。用电炉加热，同时接通冷却水，勿使漏气。用电炉加热，同时接通冷却水，馏出液搜集于馏出液搜集于100mL容量瓶或量筒中。待容量瓶或量筒中。待馏出液到达刻度时，立刻停顿搜集留意：馏出液到达刻度时，立刻停顿搜集留意：不能超越刻度。将馏出液倒入量筒中，不能超越刻度。将馏出液倒入量筒中，稍加搅动，使之均匀，将酒精计与温度计稍加搅动，使之均匀，将酒精计与温度计同时置入量筒，测定酒精度与温度。同时置入量筒，测定酒精度与温度。