第一节 工业生产常用的微生物一、工业生产常用的微生物* 从自然界中分离出来就能被利用； 对野生菌株进行人工诱变，得到突变株才能被利用。 使用重组DNA技术改造的菌株目前育种总趋势 从野生菌转向变异菌从野生菌转向变异菌 自然选育转向代谢育种自然选育转向代谢育种 从诱发基因突变转向基因重组的定向育种从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。第二章 生物工业菌种与种子的扩大培养 由于发酵工程本身的发展以及遗传工程的介入，藻类藻类（alga）、病毒（）、病毒（virus）等也正在逐步地变为工业生产用的生物。 尽管如此，目前人们对微生物的认识还是十分不够的。已经初步研究的不超过自然界微生物总量的10%左右。 微生物的代谢产物据统计已超过一千三百多种，而大规模生产的不超过一百多种； 微生物酶有近千种，而在工业上利用的不过四五十种。可见潜力是很大的。 在工业生产中常用的微生物主要有细菌、酵母菌、霉菌和放线菌。 工业生产常用的细菌有工业生产常用的细菌有 枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 乳酸杆菌乳酸杆菌(Lactobacillus lactics) 醋酸杆菌醋酸杆菌(Acetobacter) 棒状杆菌棒状杆菌(Corynebacterium) 短杆菌短杆菌(Brevibacterium) 用于生产：用于生产： 生产淀粉酶生产淀粉酶(amylase） 蛋白酶（蛋白酶（proteinase） 乳酸乳酸(lactic acid) 醋酸醋酸(acetic acid) 氨基酸氨基酸(amino acid) 肌苷酸肌苷酸(inosinic acid) 细菌（bacteria）： 属于单细胞原核生物（ unicellular prokaryote），），以典型的二分分裂(binary)方式繁殖。 细胞生长时细胞生长时，环状染色体（chromosome）被复制，细胞内的蛋白质等组分同时增加一倍，然后在细胞中部产生一横段间隔，染色体被分开，继而间隔分裂形成两个相同的子细胞。 如间隔不完全分裂就形成链状细胞。 酵母菌（酵母菌（yeast） 酵母菌为单细胞真核生物（ unicellular eukaryote），在自然界 中普遍存在，主要分布于含糖质较多的的酸性环境中，如水果、蔬菜、花蜜（nectar）和植物叶子上，以及果园土壤中。石油酵母（petroleum yeast）较多地分布在油田周围的土壤中。 酵母菌大多为腐生，常以单个细胞存在，以发芽形式进行繁殖。母细胞体积长到一定程度时就开始发芽。芽长大的同时母细胞缩小，在母子细胞间形成隔膜，最后形成同样大小的两个细胞。如果子芽不与母细如果子芽不与母细胞脱离就形成链状细胞，称为假菌丝胞脱离就形成链状细胞，称为假菌丝(pseudomycelium)。 工业上用的酵母菌有：啤酒酵母( Saccharomyces cerevisiae)、假丝酵母(Candida)、类酵母(Saccharomycodes)等，用于酿酒(Brewing)、制造面包、制造低凝固点石油、生产脂肪酶（lipase），以及生产可食用、药用和饲料用酵母菌体蛋白等。真真核核细细胞胞结结构构示示意意图图 霉菌（霉菌（mould） 霉菌不是一个分类学上的名词。凡生长在营养基质上形成绒毛状、网状或絮状菌丝的真菌(fungi)统称为霉菌。 霉菌在自然界分布很广，大量存在于土壤、空气、水和生物体内外等处。它喜欢偏酸性环境，大多数为好氧性(aerobiotic)，多腐生，少数寄生。霉菌的繁殖能力很强，它以无性孢子和有性孢子进行繁殖，大多以无性孢子繁殖为主。 生长方式是菌丝末端的伸长和顶端分支，彼此交错呈网状。菌丝的长度即受遗传性的控制，又受环境的影响，其分支数量取决于环境条件。菌丝或呈分散生长，或呈菌丝团状生长。 工业上常用的霉菌有：工业上常用的霉菌有： 藻状菌纲的根霉、毛霉、犁头霉，子囊菌纲的红曲霉，半知菌类的曲霉、青霉等； 产品产品： 酶制剂（enzyme preparation）、抗生素(antibiotic)、有机酸（organic acid）及甾体激素（steroid hormone） 等。 放线菌放线菌(Actinomycetes) 放线菌因菌落呈放线状而得名。它是一个原核生物类群，在自然界中分布很广，尤其在含有机质丰富的微碱性土壤中较广。大多腐生，少数寄生。 放线菌主要以无性孢子进行繁殖，也可借菌丝片段进行繁殖。后一种繁殖方式见于液体沉没培养（submerged cultures）中。其生长方式是菌丝末端伸长和分支，彼此交错成网状结构，成为菌丝体。菌丝长度即受遗传性的控制，又与环境相关。 在液体沉没培养中由于搅拌器（agitator）的剪应力作用，常常形成短的分支旺盛的菌丝体，或呈分散生长，或呈菌丝团状生长。它的最大经济价值在于能产生多种抗生素（antibiotics）。）。从微生物中发现的抗生素，有60%以上是放线菌产生的，如链霉素、红霉素、金霉素、庆大霉素等。 常用的放线菌主要来自以下几个属：链霉菌属、小单孢菌属和诺卡氏菌属等。 其他生物：其他生物： A: 担子菌（担子菌（Basidiomycetes ）：所谓的担子菌就是人们通常所说的菇类(mushroom)生物。担子菌资源的利用正愈来愈引起人们的重视，如多糖(polysaccharide)、抗癌(anticancer)药物的开发。 近几年来，日本、美国的一些科学家对香菇的抗癌作用进行了深入的研究，发现香菇中的“1，2-葡萄糖苷酶”及两种糖类物质具有抗癌作用。 B：病毒：病毒(virus) 其特点如下： 1. 形体微小，体积比细菌小的多。 2. 没有细胞结构，是一种独特分子的生物，主要由核酸和蛋白质构成。 3. 营寄生生活，由于缺乏独立代谢的酶体系，不能脱离寄主而自行生长繁殖，有专一性。 人类免疫缺陷病毒 （ human immunodeficiency virus ，HIV ）获得性免疫缺陷综合症（ acquired immunodeficiency syndrome， AIDS ） 噬菌体（phage）是病毒的一种。 ：烈性噬菌体和温和噬菌：烈性噬菌体和温和噬菌体概念与区别。体概念与区别。 噬菌体在寄主细胞中的生长繁殖过程可分为吸附、浸入、增殖、成熟和释放。 C：藻类（：藻类（alga）： 培养螺旋藻，按干重计算每公顷可收获60吨，而种植大豆每公顷才可获4吨；从蛋白质产率来看，螺旋藻是大豆28倍。 培养珊列藻，从蛋白质产率计算，每公顷珊列藻所得蛋白质是小麦的20-35倍。此外，还可通过藻类将CO转变为石油，培养单胞藻或其他藻类而获得的石油，可占细胞干重得5%-50%,合成的油与重油相同，加工后可转变汽油、煤油、和其他产品。 有的国家已建立培植单胞藻的农场，每年每公顷地培植的单胞藻按5%干物质为碳水化合物（石油）计算，可得60吨石油燃料。此项技术的应用，还可减轻因工业生产而大量排放CO造成的温室效应。 国外还有人从“藻类农场”获取氢能的报道，大量培养藻类，利用其光合放氢作用来取得氢能。藻藻 类类 工工 厂厂 二、 微生物工业对菌种的要求微生物工业对菌种的要求 目前，随着微生物工业原料的转换和新产品的不断出现，势必要求开拓更多新品种。尽管微生物工业用的菌种多种多样，但作为大规模生产，对菌种则有下列要求： (1)廉价原料、生长迅速、目的产物产量高。 (2)易于控制培养条件，酶活性高；发酵周期较短。 (3)抗杂菌和嗜菌体的能力强。 (4) 菌种纯，不易变异和退化，不产生任何有害的生物活性物质和毒素，保证安全生产。 在筛选所需的菌种时应考虑的一些重要的指标： （1） 菌种的营养特征： （2） 菌种的生长温度： （3） 菌种对所采用的设备及生产过程的适应性： （4） 菌种的稳定性： （5） 产物的得率和产物的浓度： （6） 产物容易回收： 能满足（3）（6），则有希望成为效益较高的生产菌种。第二节第二节 菌种的衰退、复壮与保藏菌种的衰退、复壮与保藏 一、微生物菌种衰退的原因一、微生物菌种衰退的原因 1. 原因原因 一是菌种保藏不妥; 二是菌种生长的要求没有得到满足，或是遇到不利的条件，或是失去某些需要的条件； 三是经诱变获得的新菌株发生回复突变回复突变，从而丧失新的特征的情况。 连续传代是菌种退化的直接原因，这是由于菌种经常处于旺盛的生长状态。 衰退菌株的特点：个体或群体特征发生变化；生产能力降低；代谢能力降低；发酵周期延长；抗不良环境能力降低。 2 防止菌种衰退的措施 菌种的分离菌种的分离: 因为在菌种发生衰退的同时，并不是所有的菌体都衰退，其中未衰退的菌体往往是经过环境条件考验的，具有更强的生产能力。 因此，对于已衰退的菌株采用单细胞菌株分离单细胞菌株分离的措施，即用稀释平板法或用平板划线法，以取得单细胞所长成的菌落（colony），再通过菌落和菌体的特征分析和性能测定，就可获得具有原来形状的菌株，甚至性能更好的菌株（strain）。）。 如果菌种已经发生退化，产量下降，则要进 行分离复壮。 如对芽孢杆菌(Bacillus)，可先将菌液用沸水处理几分钟，再用平板进行分离，从所剩下的孢子中挑选出最优的菌体。 如果遇到某些菌株即使进行单细胞分离，仍不能达到复壮的效果，则可改变培养条件，达到复壮的目的。 如AT3.942栖土曲霉(Aspergillus terricola)的产孢子能力下降，可适当提高培养温度，恢复其能力。 同时通过实验选择一种有利于高产菌株而不利于低产菌株的培养条件。 其它防其它防 衰衰 措措 施施n菌种的复壮n提供良好的环境条件n使用优良的保存方法n定期纯化菌种二 、 菌种的复壮n通过分离达到复壮:菌落纯菌落纯/细胞纯细胞纯 在琼脂平板划线、涂布或与琼脂培养基混合培养再分离，达到菌落纯菌落纯 采用单细胞或单孢子分离法达到细胞细胞纯纯n通过寄主体达到复壮: 对于寄生性微生物的退化菌株,将菌株接种到寄主细胞进行繁殖达到复壮。 三、菌种保藏（strain preservation） 基本原理基本原理：根据菌种的生理、生化特点，人为地创造条件，使菌种的代谢活动处于休眠状态。 要求：要求：维持菌种的存活和减少菌种的变异，尽量使菌种保持原来优良的生产性能。 保藏时首先选择优良纯菌种优良纯菌种，最好是它们的休眠体如孢子（ spore）、芽孢 (gemma)等；其次是要创造一个有利于休眠的环境条件，如低温、干燥、缺氧和缺乏营养物质等，使菌体的代谢活动处于最低状态，延长其保存期。 保存方法：保存方法： 应能较长期地保存原有菌种的优良性能，使菌种稳定，同时也要考虑到方法本身的经济简便。不同的菌种有不同的保存方法，以便长期保藏。 酵母菌酵母菌：定期移植斜面低温保藏法。也可采用石蜡油封保藏法。 霉菌：霉菌：斜面保藏法和沙土管保藏法。 细细菌菌和和放放线线菌菌：一般细菌以采用冷冻干燥保藏法为佳。 放线菌可用沙土或冷冻保藏法保藏。短期可采用斜面保藏。 保藏应注意的问题保藏应注意的问题： 菌体状态：休眠体 基质：营养贫乏 操作过程：不应对细胞造成伤害不应对细胞造成伤害 工业生产中微生物育种的基本方法包括自然选育、诱变育种、抗性菌种选育、代谢控制育种及基因重组定向育种等。 育种就是要改善菌种的特性，使之能提高产量、改进质量、降低成本、改进工艺、方便管理及综合利用等。 代谢控制育种主要有两个方面： 改变代谢通路的育种 改变代谢自动调节系统的育种第三节第三节 菌种的选育菌种的选育 一、自然选育 采样 增殖培养 从自然界选育菌株 纯种分离 性能鉴定 从自发突变中选育菌株 二、诱变育种 按照生产的要求，根据生物的遗传和变异的理论，用人工的方法造成菌种变异，再经过筛选、而达到菌种诱变选育的目的。 诱变育种一般采用物理、化学诱变剂使微生物DNADNA的碱基的碱基排列发生变化，以使排列错误的DNA模板形成异常的遗转信息，造成某些蛋白结构变异，而使细胞功能发生改变。原种（出发菌株）纯化斜面培养完全培养基同步培养离心洗涤玻璃珠震荡分散过滤单细胞或孢子悬浮液 活菌计数诱变处理 诱变处理预备实验 处理液活菌计数平板分离 形态变异并计算其变异率斜面培养 初筛、复筛 自然分离和再复筛 保藏及扩大试验诱变育种 出发菌株的选择 诱变剂的选择 诱变操作及培养 突变株的筛选 突变高产基因的表现 形态突变 高产突变 耐药性突变 营养缺陷型突变 结构类似物抗性突变出发菌株（parent strain）选择应考虑的问题n出发菌株的稳定性：n选用具备优良特性的菌株：n挑选对诱变剂敏感的菌株：n注意菌株的生理状态及生长发育时间： 野生菌株 自发突变后获得的高产菌株 已经诱变过的菌株出发菌株考虑试验菌株的遗传背景：各种诱变剂有不同的作用机制，一种诱变剂的作用常主要集中在DNA的某些特异部位上，多次反复用一种诱变因子易出现 “饱和”或恢复突变现象，因此诱变时常采用多种不同的诱变因子或复合诱变因子。诱 变 剂 的 选 择菌悬液的制备菌悬液的制备 单细胞悬浮液：单细胞悬浮液：10106 6个个/mL/mL 孢子悬浮液：孢子悬浮液：10108 8个个/mL/mL诱变：预实验确定适宜的诱变条件诱变：预实验确定适宜的诱变条件筛选：选择合适的筛选方法筛选：选择合适的筛选方法随机筛选方法：随机筛选方法： 菌种经诱变处理后,进行平板分离,随机挑选单菌落,从中筛选高产菌株。为了提高筛选效率，发展了一些快速筛选方快速筛选方法（包括摇瓶筛选法，琼脂块筛选法等），并归纳出筛选高法（包括摇瓶筛选法，琼脂块筛选法等），并归纳出筛选高产菌的培养基产菌的培养基选择准则: 1、制备一系列含有各种类型营养成分（生长限制因素）培养基； 2、避免使用容易同化的碳源或氮源，（引起分解代谢物阻遏）； 3、加入缓冲液以减少pH的变化； 4、确定含有所需的辅助因子。 生长因子产生菌（对应于营养缺陷型）的筛选：生长因子产生菌（对应于营养缺陷型）的筛选： 通过观察分离菌能否促进营养缺陷型（auxotroph）的生长，便可检出生长因子产生菌。 抗反馈突变株（抗结构类似物）的筛选抗反馈突变株（抗结构类似物）的筛选 ： 结构类似物具有和代谢产物代谢产物相似的反馈调节作用，但又不同于代谢物，不具有正常的生理功能，对细胞代谢又阻碍作用。 由于突破了原有的反馈调节系统，这些突变株就可以产生大量的该种代谢物。 理性化筛选理性化筛选高通量筛选（筛选（high throughput screening):将许多模型固定在将许多模型固定在各自不同的载体上，用机器人加样，培养后用计算机记录结各自不同的载体上，用机器人加样，培养后用计算机记录结果，并进行分析，使筛选从繁重的劳动中解脱出来，实现大果，并进行分析，使筛选从繁重的劳动中解脱出来，实现大规模筛选。规模筛选。 细胞模型：细胞模型：观察待测样品对细胞的作用，只能反映药物对细胞生长等过程的综合作用，不能反映作用的途径和靶点。包括各种正常细胞和病理细胞。 分子模型：分子模型：包括受体、酶，其特点是药物作用的靶点明确。 通过高通量筛选方法，可以发现效果好、临床应用价值通过高通量筛选方法，可以发现效果好、临床应用价值高的创新药物，治疗疑难病症。高的创新药物，治疗疑难病症。 高通量筛选筛选诱变育种的几个概念n形态突变型：指发生细胞形态变化或菌落形态变化的突变 型 n生化突变型：没有形态效应的突变型，如营养缺陷型n致死突变型：生活力下降的突变型n条件致死突变型：在某些条件下能成活，在另一些条件 下是致死的突变型n营养缺陷型突变株：由于代谢障碍而成为必须添加某种物 质才能生长的突变株n温度敏感性突变株：可在某一温度下生长而在另一温度下 不能生长的突变型 第四节 生产菌株的改良 杂交育种：两个不同基因型的菌株通过结合或原生质体融合使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选出具有新性状的菌株。 一、常规的杂交育种:不须用脱壁酶处理，就能使细胞结合而发生遗传物质重新组合。 二、原生质体融合：原生质体的制备、原生质体的融合、融合子的选择、实用型菌株的筛选。1. 标记菌株的筛选：对两亲株要进行标记，以提高筛选率。 2.原生质体的制备：用相应的酶脱去菌体的细胞壁，制得完整的原生质体。3.原生质体的融合与再生：两原生质体在促融因子的存在下，发生融合，重建细胞壁，形成新的细胞。4.融合子的选择：在选择培养基上，通过两个亲本的遗传标记互补而选择融合子。三、DNA重组技术(分子生物学)n目标DNA片段的获得n与载体DNA分子的连接n重组DNA分子引入宿主细胞n重组体的选择与鉴定n外源基因的表达 第四节第四节 种子扩大培养种子扩大培养 一. 种子扩大培养的任务 工业生产规模的增大 需要种子就增多 种子的扩大培养 种子扩大培养的任务，不但要得到纯而壮的培养种子扩大培养的任务，不但要得到纯而壮的培养物，还要获得活力旺盛的、性能稳定、接种数量足物，还要获得活力旺盛的、性能稳定、接种数量足够的、纯的培养够的、纯的培养物。物。 菌种的活化与种子的扩大培养的区别？菌种的活化与种子的扩大培养的区别？ 菌种扩大培养的目的 为发酵罐的投料提供足够数量的代谢旺盛的种发酵罐的投料提供足够数量的代谢旺盛的种子子。因为发酵时间的长短和接种量的大小有关，接种量大，发酵时间则短。将较多数量的成熟菌体接入发酵罐中，就有利于缩短发酵时间，提高发酵罐的利用率，并且也有利于减少染菌的机会。 对于不同产品的发酵过程来说，必须根据菌种生长繁殖速度快慢及生产的规模决定种子扩大培养的级数。 二二. 种子扩大培养种子扩大培养(制备制备)阶段阶段 实验室种子的制备：实验室种子的制备： 生产车间种子制备生产车间种子制备: A 实验室种子的制备：实验室种子的制备： e.g 产黄青霉菌产黄青霉菌(P.chrysogonum) 原始菌种 斜面试管 获得孢子 250ml 茄子瓶（大米或小米） 25 28 ，414天 成熟（在真空下抽去水分，使水分含量在10%以下，于4 冰箱保存）。对于不产孢子的赤霉素生产菌（Gibberelline fujikuroi），也可用大米固体培养基在大米固体培养基在茄子瓶中培养菌丝体，用作种子罐种子。 产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，如产链霉素的灰色链霉菌（Sgriseus ），产卡那霉素的卡那链霉菌（Skanamyceticu），可以用摇瓶液体培养法摇瓶液体培养法，孢子接入含液体培养基的摇瓶中，于摇床上培养，获得菌丝体，作为种子。 不产孢子的细菌，如生产谷氨酸的棒状杆菌（Corynebacterium）、短杆菌（Brevibacterium），生产上一般采用斜面斜面营养细胞进行扩培，再转入液体摇瓶培养，获得细胞悬液再接种。 e.g. Glutamic acid-producer：（谷氨酸生产菌）：（谷氨酸生产菌）原始菌种（出发菌种） 固体试管斜面（32 C ，1824小时） 三角瓶培养（摇床）(flask culture) 种子罐培养 e.g. yeast：原始菌种（出发菌种） 10ml 麦汁试管 250ml 三角瓶培养 （27 C 28 C ，3天） （25C， 2天） 510 L卡氏罐（15 C 20 C ，35天）B：生产车间种子制备：生产车间种子制备：种子罐的作用：使有限数量的孢子(菌体)发芽、生长、并繁殖成大量的菌丝体(菌体)，满足发酵罐的需要（菌体生长和产物形成）。实验室种子进入种子罐有孢子进罐法孢子进罐法和摇瓶菌种和摇瓶菌种进罐法。种子罐级数的确定：种子罐级数是指制备种子逐级扩种子罐级数的确定：种子罐级数是指制备种子逐级扩培的次数。培的次数。 依据：菌种生长特性，孢子发芽及菌体繁殖的速度以及所用的发酵罐的容积。种子罐(seeding tank)的级数产物的品种生产规模工艺条件种子罐级数越少越好，原因： 简化生产工艺和控制减少接种带来的染菌机会需考虑：尽量延长发酵罐生产产物的时间，缩短由于种子发芽、生产而占用的非生产时间，以提高发酵罐的生产率产物mlh。 e.g. Glutamate fermentation 一级种子扩培 实验室种子 种子罐 发酵罐 e.g. penicillin fermentation 二级种子扩培 实验室种子 一级种子罐 二级种子罐 发酵罐 e.g.Streptomycin fermentation 三级种子扩培实验室种子 一级种子罐 二级种子罐 三级种子罐 发酵罐 (Streptomyces griseus)灰色链霉菌 种龄与接种量：种龄与接种量：种龄种龄(seed age)指种子罐培养种子从开始至结束的培养时间。指种子罐培养种子从开始至结束的培养时间。在种子罐中，培养时间延长菌体量增加基质消耗及代谢产物积累菌体量不再增加老化过老：生产能力下降，菌体自溶。过嫩：前期生长缓慢，发酵周期延长，产物形成时间推迟，甚至造成异常发酵。 适宜时间：以菌体处于生命力极为旺盛的对数生长期（以菌体处于生命力极为旺盛的对数生长期（exponential phase），且培养液中菌体量还未达到最高峰时，较为适宜。），且培养液中菌体量还未达到最高峰时，较为适宜。 嗜碱性芽孢杆菌（Bacillus alkalophilus)生产碱性蛋白酶（alkaline proteinase/protease） ，培养小时接种，酶活最高。 接种量接种量(seed volume)指移入的种子的体积和接种后培养液的体积指移入的种子的体积和接种后培养液的体积比比。Antibiotic： 7%7.5% Glu： 1%接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中的繁殖速度。采用较大接种量可以缩短发酵罐中菌体繁殖到达高峰的时间，使产物形成提前。 原因：1、种子多，种子液中含有大量的胞外水解酶，有利于对基 质的利用 、生产菌迅速占据了整个培养环境，减少染菌机会。 但过多，易使菌体（菌丝体）生长过快，培养液粘度增加，溶氧降低，产物合成受影响。 e.g. 嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶 接种1%，酶活最高；1.5%4%影响不大；大于4%，酶产量明显下降。 制霉菌素生产中，1%比10%效果好，0.1%与1%效果相当。 发酵生产的趋势：采取大接种量及丰富培养基。发酵生产的趋势：采取大接种量及丰富培养基。 如谷氨酸： 大接种量20% ，高生物素，高青霉素的强制发酵工艺。 有的采用双种法增大接种量：有的采用双种法增大接种量：两只种子罐 一只发酵罐 如卡那霉素：双种比单种的发酵单位（fermentation titer unit）提高8%，到达产量 高 峰的 时间提前。 倒种法：倒种法：将培养适宜的发酵液倒出适量给另一个发酵罐作为种子。 如 链霉素：倒种法比单种法的发酵单位提高12%。 三三. 影响种子质量的因素影响种子质量的因素 1. 原材料质量：原材料质量：如四环素、土霉素生产中配制孢子培养基的麸皮（wheat bran）、霉菌用的大（小）米、琼脂的牌号的不同、蛋白胨加工原料不同等均影响种子的质量。原料质量的波动，起主要作用的是其中的无机盐含量的不同，如微量元素Mg+、Ca + 、Ba+能刺激孢子的形成。P含量的多少也影响种子的质量。氨基酸发酵中，淀粉水解糖制备后，加入其他的营养物（麸皮水解液、豆饼水解液、玉米浆），也对种子质量多少有些影响。一般情况：培养基糖分要少，氮源要多，无机盐所占的比例要大。一般情况：培养基糖分要少，氮源要多，无机盐所占的比例要大。种子罐和发酵罐培养基成分趋于一致也有好处，种子很快适应，但各成种子罐和发酵罐培养基成分趋于一致也有好处，种子很快适应，但各成分的数量根据目的各自确定。分的数量根据目的各自确定。总之，各成分选择得当，才能发挥菌种的特征，提高产量。2. 培养条件：培养条件：温度、温度、pH值、湿度、培养时间和冷藏时间等都影响种子质量。值、湿度、培养时间和冷藏时间等都影响种子质量。制备斜面孢子培养基的湿度湿度对孢子的数量影响很大。如土霉素生产菌种龟裂霉菌的孢子，在北方干燥地区孢子斜面长的快，在含少量水分的试管斜面培养基中下部孢子长的好，而上部孢子稀少；气温高，湿度大的地区，斜面孢子长的慢，试管下部冷凝水多而不利于孢子形成。 一般相对湿度一般相对湿度4045%时孢子数量最多，孢子颜色均匀，质量较好时孢子数量最多，孢子颜色均匀，质量较好。培养时间和冷藏时间对种子和孢子形成都有影响。培养时间和冷藏时间对种子和孢子形成都有影响。如土霉素菌种孢子斜面培养四天左右，即于4冰箱保存，发现冷藏78天菌体自溶，而培养五天以后冷藏，20天未发现自溶。链霉素生产菌，斜面孢子在6 冷藏两个月后的发酵单位比冷藏一个月降低8%。 四. 种子质量的控制措施 必须保证生产菌种的稳定性 提供种子培养的适宜环境条件，保证无杂菌侵入 1. 菌种稳定性的检查： 少量菌种-无菌生理盐水-递增稀释-平板划线培养。 挑出形态整齐，孢子丰满的菌落进行摇瓶试验，测定其生产能力。 2. 无菌检查： 显微镜观察、种子液进行无菌检验、生化分析。 种子液平板划线、斜面培养用肉眼观察是否有异常菌落、异常现象及镜检是否有杂菌。五五. 种子质量的判断种子质量的判断： 考察种子在发酵罐中所表现出来的生产能力。考察种子在发酵罐中所表现出来的生产能力。感官判断：看颜色、闻气味 理化指标测定： 1、pH值 2、培养基灭菌后的糖、氨基氮 3、菌体形态、浓度 4、产物量 5、残糖浓度 6、酶活力 （如土霉素生产，淀粉酶的活力与发酵单位有一定的关系）。六六. 工业微生物培养的类型工业微生物培养的类型 静置培养法：静置培养法：即将培养基盛于发酵容器中，在接种后，不通 空气进行培养发酵，也称为嫌气性培养 (anaerobic culturing)通气培养法通气培养法：生产菌种以需氧菌和兼性需氧菌居多，它们生长 的环境必须供给空气，以维持一定的溶解氧水平 ， 使菌体迅速生长和发酵，也称为好气性 培养 (aerobic culturing)。 1 表面培养法（表面培养法（surface culturing)： 好氧静置培养法。针对容器内培养基物形态又分为液态表面培养和固体表面培养。相对于容器内培养基体积而言，表面积越大，越易促进氧气由气液界面向培养基内传递。 这种方法菌的生长速度与培养基的深度有关，单位体积的表面积越大，生长速度越快。 2 固体培养（发酵）法固体培养（发酵）法(solid culturing)： 固体培养又分为浅盘(shallow pan)固体培养和深层固体培养，统称曲法培养。它起源于我国酿造生产特有的传统制曲技术。其最大特点是固体曲的酶活力高。 3 液体深层培养（发酵）法：液体深层培养（发酵）法：(liquid submerged culturing) 液体深层发酵法从罐底部通气，进入的空气由搅拌桨叶分散成微小气泡以促进氧的溶解。这种由罐的底部通气搅拌的培养方法，相对于由气液界面靠自然扩散使氧溶解的表面培养法来讲，称为深层培养法。 液体曲(liquid koji)、柠檬酸、谷氨酸、肌苷酸(inosinic acid)及其他发酵产品先后采用此法进行生产。特点：容易按照生产菌种对于代谢的营养要求以及不同特点：容易按照生产菌种对于代谢的营养要求以及不同生理时期的通气、搅拌、温度、培养基中氢离子浓度等条件，生理时期的通气、搅拌、温度、培养基中氢离子浓度等条件，选择最佳培养条件。选择最佳培养条件。外循环带升式发酵罐 内循环带升式发酵罐 小型机械搅拌发酵罐小型机械搅拌发酵罐1三角皮带转轴；2轴承支架；3联轴节；4轴封；5窥镜；6取样口；7冷却水出口；8夹套；9螺旋片；10温度计接口；11轴；12搅拌器；13底轴承；14放料口；15冷水进口；16通风管；17热电偶接口；18挡板；19接压力表；20手孔；21电动机；22排气口；23取样口；24进料口；25压力表接口；26窥镜；27手孔；28补料口深层培养的几个主要控制点深层培养的几个主要控制点A 灭菌灭菌(sterilization)：发酵工业要求纯培养。纯培养。因此在种子培养前必须对培养基进行加热灭菌。B 温度控制：温度控制：培养基灭菌后，冷却至培养温度进行培养，由于随着微生物的生长和繁殖，会有热量产生、搅拌产热等，所以为维持温度恒定。 C 通气通气(aeration)、搅拌、搅拌(agitation)： 空气进入发酵罐前先经过空气过滤器除去杂菌，制成无菌空气，而后由罐底部进入，再通过搅拌将空气分散成微小气泡。 搅拌的目的：增加溶解氧；使基质混合均匀；促进热传递 。（培养液中的微生物均匀地分散在种子罐内，并使加入的酸和碱均匀分散等）。