第六章第六章 原核基因表达调控原核基因表达调控Control of gene expression in prokaryote主要内容主要内容1 概概 述述2 乳糖操纵子乳糖操纵子3 色氨酸操纵子色氨酸操纵子4 应急应答应急应答5 RNARNA对基因表达的调控对基因表达的调控6 翻译对基因表达的调控翻译对基因表达的调控7 小小 结结 1.1 几个根本概念几个根本概念 1.2 基因或操纵子表达调控水平基因或操纵子表达调控水平 1.3 调控的类型与特点调控的类型与特点1 概概 述述1.1 几个根本概念几个根本概念1.1.1 顺式作用元件与反式作用因子顺式作用元件与反式作用因子1.1.2 结构基因与调控基因结构基因与调控基因1.1.3 阻抑物、操纵基因与操纵子阻抑物、操纵基因与操纵子1.1.4 正调控与负调控正调控与负调控1.1.5 诱导与阻遏诱导与阻遏 顺式作用元件顺式作用元件cis-acting elementcis-acting element: : 不转变为其他形式不转变为其他形式RNARNA或蛋白质而只以或蛋白质而只以DNADNA形式在原来位置对基因表达起作用的形式在原来位置对基因表达起作用的DNADNA序列。序列。发挥作用的过程称顺式作用。发挥作用的过程称顺式作用。 反式作用因子反式作用因子trans-acting factortrans-acting factor: : 能从合成地点扩散到其它场所对其他基因能从合成地点扩散到其它场所对其他基因的表达起调控作用的蛋白质因子有时为的表达起调控作用的蛋白质因子有时为RNARNA。发挥作用的过程称反式作用。发挥作用的过程称反式作用。1.1.1 顺式作用元件与反式作用因子顺式作用元件与反式作用因子 结构基因结构基因structural gene 编码各类具有不同结构和功能的蛋白质和编码各类具有不同结构和功能的蛋白质和RNA的的基因。基因。 调控基因调控基因regulator gene 编码蛋白质或编码蛋白质或RNA来调节其他基因表达的基因。来调节其他基因表达的基因。1.1.2 结构基因与调控基因结构基因与调控基因阻抑物阻抑物repressor: 阻止基因表达的蛋白质，可与操纵基因阻止基因表达的蛋白质，可与操纵基因结合来阻止转录或结合结合来阻止转录或结合RNA来阻止蛋白质的翻译。来阻止蛋白质的翻译。操纵基因操纵基因operator: DNA上的一个位点，阻抑物能与之结上的一个位点，阻抑物能与之结合抑制相邻启动子起始转录。合抑制相邻启动子起始转录。操纵子操纵子operon: 细菌基因表达和调控的单位，包括结构细菌基因表达和调控的单位，包括结构基因和能被调控基因产物识别的基因和能被调控基因产物识别的 DNA控制元件。控制元件。1.1.3 阻抑物、操纵基因与操纵子阻抑物、操纵基因与操纵子 正调控正调控positive control: 调控因子通过与启调控因子通过与启动子元件结合来激活基因的表达。动子元件结合来激活基因的表达。负调控负调控negative control: 阻抑物与操纵基因阻抑物与操纵基因结合来阻止基因的表达。结合来阻止基因的表达。1.1.4 正调控与负调控正调控与负调控诱导诱导 (induction)： 通过小分子诱导物参与通过小分子诱导物参与, 使阻抑物失活或活化使阻抑物失活或活化激活剂来实现对基因或操纵子表达的调控激活剂来实现对基因或操纵子表达的调控 。阻遏阻遏(repression): 通过小分子辅阻遏物参与通过小分子辅阻遏物参与,使激活剂失活或活化使激活剂失活或活化阻抑物来实现基因或操纵子不表达的调控。阻抑物来实现基因或操纵子不表达的调控。1.1.5 诱导与阻遏诱导与阻遏1. 2 表达调控水平表达调控水平1.2.1 转录水平转录水平 (1) DNA的结构的结构 (2) RNA聚合酶的功能聚合酶的功能 (3) 蛋白因子及其他小分子配基的相互作用蛋白因子及其他小分子配基的相互作用1.2.2 转录后水平转录后水平 (1) 翻译的起始、延伸及终止翻译的起始、延伸及终止 (2) 蛋白质产物的加工、修饰、折叠及转运蛋白质产物的加工、修饰、折叠及转运1.3 调控类型与特点调控类型与特点负控诱导系统负控诱导系统正控诱导系统正控诱导系统负控阻遏系统负控阻遏系统正控阻遏系统正控阻遏系统1.3 调调控控类类型型与与特特点点2 乳糖操纵子乳糖操纵子 2.1 乳糖操纵子的结构组成乳糖操纵子的结构组成2.2 乳糖操纵子的调控模型乳糖操纵子的调控模型2.1 乳糖操纵子的结构组成乳糖操纵子的结构组成The lac operon includes cis-actihng regulator elements and protein-coding structural genes2.2 乳糖操纵子的调控模型乳糖操纵子的调控模型2.2.1 乳糖操纵子的负调控乳糖操纵子的负调控2.2.2 乳糖操纵子的正调控乳糖操纵子的正调控 (1) 负调控位点负调控位点-操纵基因操纵基因 位置位置; 序列特征序列特征(2) 调节因子调节因子-阻抑物阻抑物 结构特征结构特征; 活性控制活性控制(3) 阻抑物与操纵基因的作用分析阻抑物与操纵基因的作用分析(4) 乳糖操纵子的负控诱导系统乳糖操纵子的负控诱导系统2.2.1 乳糖操纵子的负调控乳糖操纵子的负调控Repressor and RNA polymerase bind at sites that overlap around the transcription startpoint of the lac operon.-5+21Lac 操纵基因的位置操纵基因的位置 The lac operator has a symmetrical sequence. The sequence is numbered relative to the startpoint for transcription at +1. Lac 操纵基因的序列特征操纵基因的序列特征Lac阻抑物的结构特征阻抑物的结构特征N endC endThe repressor tetramer consists of two dimers. Dimers are held together by contacts involving core domain 2 as well as by the oligomerization helix. The dimers are linked into the tetramer by the oligomerization interface.Repressor maintains the lac operon in the inactive condition by binding to the operator. The shape of the repressor is represented as a series of connected domains as revealed by its crystal structure Inducer changes the structure of the core so that the headpieces of a repressor dimer are no longer in an orientation that permits binding to DNA.Lac阻抑物的活性控制阻抑物的活性控制阻抑物与操纵基因的作用分析阻抑物与操纵基因的作用分析Lac repressor binds strongly and specifically to its operator, but is released by inducer. Virtually all the repressor in the cell is bound to DNA.Repression affects the sites at which repressor is bound on DNAThe three lac operators -83 +11 +410 O1 O3 O2 O1: AATTGTGAGCGGATAACAATTO2: AAATGTGAGCGAGTAACAACCO3: GGCAGTGAGCGCAACGCAATTO3+O2+O1: 1300; O3+O1: 440; O1+O2: 700; O3+O2: 1.9; O3: 1.0; O1: 18; O2: 1.0; No operators:1.0-foldIf both dimers in a repressor tetramer bind to DNA, the DNA between the two binding sites is held in a loop.(4) 乳糖操纵子的负控诱导系统乳糖操纵子的负控诱导系统可以对操纵子进行诱导的小分子，其结构可以对操纵子进行诱导的小分子，其结构通常与操纵子所表达的酶的底物的结构相通常与操纵子所表达的酶的底物的结构相同或类似。同或类似。-半乳糖苷含乳糖是半乳糖苷含乳糖是lacZYA基因编码基因编码的酶可识别的底物。的酶可识别的底物。-半乳糖苷不存在时，乳糖操纵子的表达水半乳糖苷不存在时，乳糖操纵子的表达水平极低。参加平极低。参加-半乳糖苷可诱导乳糖操纵子半乳糖苷可诱导乳糖操纵子中三个结构基因的转录。中三个结构基因的转录。Glucose controls expression of lac operonAddition of inducer results in rapid induction of lac mRNA, and is followed after a short lag by synthesis of the enzymes; removal of inducer is followed by rapid cessation of synthesis.2.2.2 乳糖操纵子的正调控乳糖操纵子的正调控 (1) 正调控位点正调控位点- CRP结合位点结合位点 位置位置 序列特征序列特征(2) 调节因子调节因子- CRP 结构特征结构特征 活性控制活性控制(3) CAP与靶位点的作用与靶位点的作用The CRP protein can bind at different sites relative to RNA polymerase. CRP结合位点的位置结合位点的位置CRP-binding sites are close to the promoter-41, one- 61, two- 92, oneThe consensus sequence for CRP contains the well conserved pentamer TGTGA and (sometimes) an inversion of this sequence (TCANA). CRP结合位点序列特征结合位点序列特征CRP binds to a consensus sequence 一个由两个相同亚基组成的二聚体，每个亚基一个由两个相同亚基组成的二聚体，每个亚基为为22.5 kDa, 二聚体可被单个分子二聚体可被单个分子cAMP激活。激活。 CRP单体含一个单体含一个DNA结合区和一个转录激活区。结合区和一个转录激活区。CRPCRP的结构特征的结构特征Cyclic AMP has a single phosphate group connected to both the 3 and 5 positions of the sugar ring. adenylate cyclaseATP cAMPBy reducing the level of cyclic AMP, glucose inhibits the transcription of operons that require CRP activity.The level of cyclic AMP is inversely related to the level of glucose. CRP的活性控制的活性控制cAMPAGlcCRP bends DNA 90 around the center of symmetry. CRP与靶位点的作用与靶位点的作用3 色氨酸操纵子色氨酸操纵子3.1 色氨酸操纵子的结构组成色氨酸操纵子的结构组成3.2 色氨酸操纵子的调控模型色氨酸操纵子的调控模型 3.2.1 trp操纵子的阻遏系统操纵子的阻遏系统 3.2.2 衰减子对色氨酸操纵子的表达调控衰减子对色氨酸操纵子的表达调控 3.1 色氨酸操纵子的结构组成色氨酸操纵子的结构组成The Trp OperonNote:the order of the genes follows the order of the biosynthetic pathway (1) 辅阻遏蛋白对辅阻遏蛋白对trp操纵子表达的调控操纵子表达的调控 辅阻遏蛋白辅阻遏蛋白aporepressor, trpR的产物通过与操纵的产物通过与操纵基因的结合与否来控制结构基因是否被转录。基因的结合与否来控制结构基因是否被转录。 (2) 辅阻遏蛋白的活性控制辅阻遏蛋白的活性控制 辅阻遏蛋白的活性受到色氨酸水平的控制，色氨酸与辅阻遏蛋白的活性受到色氨酸水平的控制，色氨酸与辅阻遏蛋白结合那么激活了辅阻遏蛋白，这样辅阻遏蛋辅阻遏蛋白结合那么激活了辅阻遏蛋白，这样辅阻遏蛋白就可与操纵区白就可与操纵区DNA结合，关闭结合，关闭trp操纵子的表达。操纵子的表达。3.2.1 trp操纵子的阻遏系统操纵子的阻遏系统(1) 前导序列和衰减子的序列特征前导序列和衰减子的序列特征(2) 色氨酸水平调控前导区和衰减子对应色氨酸水平调控前导区和衰减子对应RNA二级二级结构结构 (3) RNA的可变性二级结构调控衰减作用的可变性二级结构调控衰减作用3.2.2 衰减子对色氨酸操纵子的表达调控衰减子对色氨酸操纵子的表达调控(1)前导序列和衰减子的序列特征前导序列和衰减子的序列特征(2) 色氨酸水色氨酸水平调控前导区平调控前导区和衰减子对应和衰减子对应RNA二级结构二级结构+90 +140(3) RNA的可变性二级结构调控衰减作用的可变性二级结构调控衰减作用143212344 应急应答应急应答4.1 定定 义义4.2 产生的核酸堆积物产生的核酸堆积物- (p)ppGpp4.3 (p)ppGpp的产生机制的产生机制4.4 (p)ppGpp的作用的作用4.1 定义定义应急应答应急应答stringent response： 当细菌发现它们处于很差的生长环境，当细菌发现它们处于很差的生长环境，没有足够的氨基酸来维持蛋白质合成时，没有足够的氨基酸来维持蛋白质合成时，它们就会停止大局部活动，这种现象称为它们就会停止大局部活动，这种现象称为应急应答。应急应答。4.2 产生的核酸堆积物产生的核酸堆积物 应急应答产生两种非正常的核酸堆积物应急应答产生两种非正常的核酸堆积物有时又称预警子有时又称预警子(alarmone)，即，即ppGpp和和pppGpp，统称，统称(P)PPGPP。 4.3 (p)ppGpp的产生机制的产生机制应急因子应急因子RelA是一种是一种(p)ppGpp合成酶，约合成酶，约与与0.5%的核糖体结合在一起。的核糖体结合在一起。当当A位被空载位被空载tRNA占据时，占据时， RelA被激活。被激活。一个空载一个空载tRNA进入进入A位就生成一个位就生成一个(p)ppGppStringent factor catalyzes the synthesis of pppGpp and ppGpp; ribosomal proteins can dephosphorylate pppGpp to ppGpp. 4.4 (p)ppGpp的作用的作用 应急应答使得应急应答使得rRNA和和tRNA的合成量的合成量大幅减少大幅减少10-20%，一些，一些mRNA的合成的合成也减少也减少1/3。蛋白质的降解速率增加，。蛋白质的降解速率增加，许多代谢调节作用开始发生。许多代谢调节作用开始发生。Nucleotide levels control initiation of rRNA transcription. 5 5 RNARNA对基因表达的调控对基因表达的调控5.1 反义反义RNA抑制基因表达抑制基因表达5.2 小小RNA分子调节翻译分子调节翻译5.3 RNA干扰与基因沉默干扰与基因沉默5.1 反义反义RNA抑制基因表达抑制基因表达5.1.1 反义基因和反义反义基因和反义RNA的定义的定义5.1.2 反义反义RNA技术及作用原理技术及作用原理 5.1.1 反义基因和反义反义基因和反义RNA的定义的定义反义基因反义基因 (Antisense gene): 是指相对于启动子的方向，将基因反向，从而转录出是指相对于启动子的方向，将基因反向，从而转录出“反义反义RNA链给与正义链给与正义RNA互补，此时的基因互补，此时的基因称反义基因。称反义基因。反义反义RNA (Antisense RNA): 能与特异能与特异mRNA分子互补结合的一段分子互补结合的一段RNA分子。分子。5.1.2 反义反义RNA技术及作用原理技术及作用原理 反义反义RNARNA技术：技术： 利用基因重组技术，构建人工表达载体，使其离体或体内表达利用基因重组技术，构建人工表达载体，使其离体或体内表达反义反义RNARNA，从而抑制靶基因的表达，从而抑制靶基因的表达 。作用原理作用原理: :1 1复制水平：与引物复制水平：与引物RNARNA互补结合，抑制互补结合，抑制DNADNA复制。复制。2 2转录水平：转录水平：与与mRNA 5mRNA 5末端互补结合，阻止帽子结构形成；末端互补结合，阻止帽子结构形成；作用于外显子和内含子连接区，阻止前作用于外显子和内含子连接区，阻止前mRNAmRNA的剪接；的剪接； 作用于作用于poly Apoly A形成位点，阻止形成位点，阻止mRNAmRNA的成熟及其向胞浆中的转运的成熟及其向胞浆中的转运. .3 3翻译水平：可能是最主要方面，翻译水平：可能是最主要方面，互补于起始位点阻止核糖互补于起始位点阻止核糖体结合；体结合；互补于编码区阻止核糖体在互补于编码区阻止核糖体在mRNAmRNA上移动；上移动；降解靶降解靶mRNA mRNA 5.2 小小RNA分子调节翻译分子调节翻译5.2.1 小小RNA分子调节翻译机制分子调节翻译机制5.2.2 细菌内含有调节因子细菌内含有调节因子RNA5.2.3 真核生物中含有的微小调节因子真核生物中含有的微小调节因子RNA5.2.1 小小RNA分子调节翻译机制分子调节翻译机制 调节因子调节因子RNA通过与靶通过与靶RNA形成双链区域形成双链区域来行使功能，双链体可以：来行使功能，双链体可以： 阻遏翻译起始；阻遏翻译起始； 产生一个核酸内切酶作用靶点；产生一个核酸内切酶作用靶点； 引起转录终止。引起转录终止。By binding to a target RNA to form a duplex region, a regulator RNA may create a site that is attacked by a nuclease. 5.2.2 细菌内含有的调节因子细菌内含有的调节因子RNA 细菌中的调节因子细菌中的调节因子RNA是短的分子，是短的分子，统称为统称为sRNA。 E.coli 至少包含至少包含17种不同种不同sRNA，有，有一些一些sRNA是普遍的调节因子，可以影是普遍的调节因子，可以影响许多靶基因。响许多靶基因。Oxy R可被可被H2O2激激i活的激活剂活的激活剂Oxy S 靶基因之一靶基因之一 Oxy S RNA 109 碱基碱基一种在转录后水平影响基因表达的反式作用调节因子一种在转录后水平影响基因表达的反式作用调节因子超过超过10个靶基因个靶基因转录转录氧化应急反响展示了氧化应急反响展示了RNA作为调节因子的通用控制系统作为调节因子的通用控制系统的一个例子。的一个例子。oxyS RNA inhibits translation of flhA mRNA by base pairing with a sequence just upstream of the AUG initiation codon. 5.2.3 5.2.3 真核生物中含有的微小调节因子真核生物中含有的微小调节因子RNARNA本质：动物和植物基因组编码许多短的本质：动物和植物基因组编码许多短的RNA分子约分子约22个碱基，称为微小个碱基，称为微小RNAmicroRNA) 。功能：通过与靶功能：通过与靶mRNA 序列互补配对原那么来调节基因序列互补配对原那么来调节基因的表达。的表达。产生机制：先转录产生能形成双链体区域的转录物，再产生机制：先转录产生能形成双链体区域的转录物，再由酶由酶dicer)切割产生。切割产生。5.3 RNA干扰与基因沉默干扰与基因沉默RNA干扰干扰( RNA interference，RNAi ) 的定义：的定义： 指生物体内利用双链指生物体内利用双链RNA诱导同源靶基因的诱导同源靶基因的mRNA特特异性降解，从而导致转录后基因沉默的现象。异性降解，从而导致转录后基因沉默的现象。RNAi的作用机理的作用机理: 通过核酸酶通过核酸酶Dicer切割切割dsRNA生成生成21-23 nt 小干扰小干扰RNAsiRNA，继而由，继而由siRNA识别并靶向降解同源靶基因识别并靶向降解同源靶基因mRNA，从而抑制靶基因的表达。，从而抑制靶基因的表达。 enzyme6 翻译对基因表达的调控翻译对基因表达的调控6.1 翻译对基因表达的调控的两种方式翻译对基因表达的调控的两种方式6.2 r-蛋白的自主调控蛋白的自主调控6.3 自主调节控制大分子聚合物的合成自主调节控制大分子聚合物的合成6.1 翻译对基因表达的调控的两种方式翻译对基因表达的调控的两种方式一种方式一种方式: : 与与mRNAmRNA上靶区结合的蛋白质通过阻上靶区结合的蛋白质通过阻遏核糖体识别起始区来实现阻抑物的功能遏核糖体识别起始区来实现阻抑物的功能. . 另一种方式另一种方式: : 一个顺反子的翻译需要前一个顺反子一个顺反子的翻译需要前一个顺反子翻译所引起的二级结构变化来调控。翻译所引起的二级结构变化来调控。6.2 r-蛋白的自主调控蛋白的自主调控Translation of an r-protein operon can be controlled by a product of the operon that binds to a site on the polycistronic mRNA. Translation of the r-protein operons is autogenously controlled and responds to the level of rRNA.6.3 自主调节用来自主调节用来控制大分子聚控制大分子聚合物的合成合物的合成重点内容：重点内容：几个根本概念：顺式作用、反式作用、结构基因、调控基因、几个根本概念：顺式作用、反式作用、结构基因、调控基因、操纵基因、阻抑物、操纵基因、操纵子、正调调控、负调控、操纵基因、阻抑物、操纵基因、操纵子、正调调控、负调控、自主调控、反义自主调控、反义RNA、应急应答；、应急应答； 乳糖操纵子的调控模型；乳糖操纵子的调控模型；色氨酸操纵子的调控模型；色氨酸操纵子的调控模型；原核基因表达调控机制的类型原核基因表达调控机制的类型与特点；与特点；应急应答调控根本表达的根本原理；应急应答调控根本表达的根本原理；自主调控的自主调控的特点；特点；反义反义RNA在基因工程中应用的根本原理；在基因工程中应用的根本原理；小小RNA分子调控基因表达的根本原理。分子调控基因表达的根本原理。难点内容：难点内容：乳糖操纵子的调控模型；乳糖操纵子的调控模型；色氨酸操纵子的调控模型；色氨酸操纵子的调控模型；自自主调控的作用机理；主调控的作用机理；小小RNA分子调节基因表达的机制。分子调节基因表达的机制。了解内容：了解内容： 半乳糖操纵子的调控模型；半乳糖操纵子的调控模型；阿拉伯糖操纵子的调控模型；阿拉伯糖操纵子的调控模型；固氮基因的表达调控。固氮基因的表达调控。7 小小 结结