实验二 植物体内硝酸复原酶活力的测定植物生物学实验植物生物学实验-植物生理部分植物生理部分n nNO3-和NH4+是能被植物利用的最主要的氮源。在普通田间条件下， NO3- 是植物吸收的主要方式。硝酸盐的复原硝酸盐的复原硝酸盐硝酸盐硝酸复原酶硝酸复原酶亚硝亚硝酸盐酸盐氨氨亚硝酸复原酶亚硝酸复原酶 硝硝酸酸复复原原酶酶是是一一种种诱诱导导酶酶，在在植植物物体体内内本本来来不不含含有有，但但在在特特定定外外来来物物质质的的如如NO3-NO3-诱诱导导下下可以生成硝酸复原酶。可以生成硝酸复原酶。n n硝酸复原硝酸复原硝酸复原硝酸复原酶酶NRNR是植物氮素同化的关是植物氮素同化的关是植物氮素同化的关是植物氮素同化的关键酶键酶，它催，它催，它催，它催化植物体内的硝酸化植物体内的硝酸化植物体内的硝酸化植物体内的硝酸盐盐复原复原复原复原为亚为亚硝酸硝酸硝酸硝酸盐盐：n n NO3- +NADH + H+ NO2- +NAD+ +H2O NO3- +NADH + H+ NO2- +NAD+ +H2On n 产产生的生的生的生的亚亚硝酸硝酸硝酸硝酸盐盐与与与与对对- -氨基苯磺酸或氨基苯磺酸或氨基苯磺酸或氨基苯磺酸或对对氨基苯磺氨基苯磺氨基苯磺氨基苯磺酰酰胺及胺及胺及胺及 - - 萘萘胺或胺或胺或胺或萘萘基乙基乙基乙基乙烯烯胺在酸性条件下定胺在酸性条件下定胺在酸性条件下定胺在酸性条件下定量生成量生成量生成量生成红红色偶氮化合物。色偶氮化合物。色偶氮化合物。色偶氮化合物。 NR【实验原理】【实验原理】 生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝酸复原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。普通以单位时间内每克鲜重含氮量表示，即以g/g/h为单位。NR的测定可分为活体法和离体法。活体法步骤简单，适宜快速、多组测定。离体法复杂，但反复性较好。n n小麦的新颖叶片诱导组和非诱导组【实验资料】n n冷冻离心机；分光光度计；天平 (0.01g)；冰箱；恒温水浴；研钵；剪刀；离心管；移液管(5、2、1mL) ；洗耳球；试管架；(12)胶头滴管。【实验器材】n n规范曲线制造n n 取7支干净烘干的15ml刻度试管按下表顺序参与试剂，配成0-0.20g/mL的系列规范亚硝态氮溶液。摇匀后在25下保温30min，然后在540nm下比色测定。以亚硝态氮浓度g/mL为横坐标X，吸光值为纵坐标r建立回归方程。 【实验步骤】【实验步骤】管号管号管号管号1 12 23 34 45 56 67 7试剂试剂取量取量取量取量mLmL亚亚硝酸硝酸硝酸硝酸钠规钠规范液范液范液范液0 00.10.10.20.20.40.40.60.60.80.81.01.0蒸蒸蒸蒸馏馏水水水水1.01.00.90.90.80.80.60.60.40.40.20.20 01% 1% 磺胺磺胺磺胺磺胺2 22 22 22 22 22 22 20.2%0.2%萘萘基乙基乙基乙基乙烯烯胺胺胺胺 2 22 22 22 22 22 22 2每管每管每管每管亚亚硝硝硝硝态态氮氮氮氮浓浓度度度度g/mLg/mL0 00.020.020.040.040.080.080.120.120.160.160.200.20n n酶酶的提取的提取的提取的提取 称取称取称取称取0.5-1g 0.5-1g 鲜样鲜样诱导组诱导组和非和非和非和非诱导组诱导组分分分分别进别进展，剪碎置冰箱冰展，剪碎置冰箱冰展，剪碎置冰箱冰展，剪碎置冰箱冰冻冻30min30min，取出置研，取出置研，取出置研，取出置研钵钵中，中，中，中，冰浴研磨成匀冰浴研磨成匀冰浴研磨成匀冰浴研磨成匀浆浆，转转移入离心管中，洗研移入离心管中，洗研移入离心管中，洗研移入离心管中，洗研钵钵2-32-3次，次，次，次，将液体将液体将液体将液体转转入离心管中，共用提取液入离心管中，共用提取液入离心管中，共用提取液入离心管中，共用提取液6 mL6 mL，4 4 8000rpm8000rpm离心离心离心离心15min15min，上清液即，上清液即，上清液即，上清液即为为粗粗粗粗酶酶提取液。提取液。提取液。提取液。n n酶酶反响反响反响反响 取取取取4 4个个个个10 mL10 mL离心管，按照下表所列离心管，按照下表所列离心管，按照下表所列离心管，按照下表所列进进展操展操展操展操作，混匀，作，混匀，作，混匀，作，混匀，2525保温保温保温保温30min30min。n n终终止反响和比色止反响和比色止反响和比色止反响和比色测测定定定定 30min 30min后立刻参与后立刻参与后立刻参与后立刻参与l mLl mL磺胺溶磺胺溶磺胺溶磺胺溶液液液液终终止止止止酶酶反响，再加反响，再加反响，再加反响，再加l mLl mL萘萘基乙基乙基乙基乙烯烯胺溶液，胺溶液，胺溶液，胺溶液，显显色色色色30min30min后于后于后于后于4000rpm4000rpm离心离心离心离心5min5min，取上清液在，取上清液在，取上清液在，取上清液在540nm540nm下比色下比色下比色下比色测测定。根据定。根据定。根据定。根据规规范曲范曲范曲范曲线计线计算出反响液中算出反响液中算出反响液中算出反响液中亚亚硝硝硝硝态态氮氮氮氮浓浓度度度度g/mL g/mL 。 反响底物反响底物 酶反响管酶反响管 粗酶液粗酶液/mL 0.1mol/LKNO3磷磷酸缓冲液酸缓冲液/mL NADH溶溶液液/mL 0.1mol/L pH7.5磷酸缓冲液磷酸缓冲液/mL 非非诱导诱导对照对照 1.0 1.6 0 0.2 非非诱导诱导实验实验 1.0 1.6 0.2 0 诱导诱导对照对照 1.0 1.6 0 0.2 诱导诱导实验实验 1.0 1.6 0.2 0 【结果计算】【结果计算】 样样品中品中酶酶活性活性g g-1h-1g g-1h-1= = X X 反响液反响液酶酶催化催化产产生的生的亚亚硝硝态态氮氮浓浓度度g/mLg/mL；V1V1提取提取酶时酶时参与的提取参与的提取缓缓冲液体冲液体积积mLmL；V2V2酶酶反响反响时时参与的粗参与的粗酶酶液体液体积积mLmL；V3V3与磺胺等与磺胺等发发生生颜颜色反响的色反响的总总体体积积mLmL； W W 样质样质量量量量g g； t t 反响反响时间时间h h。X * V3 / V2 * V1W * t【本卷须知】 n n硝酸复原酶容易失活，离体法测定时，操作应迅速，并且在4下进展。n n制造规范曲线时，从显色到比色时间尽能够坚持一致，显色时间过长或过短对颜色都有影响。【思索与作业】【思索与作业】n n 比色测定前参与磺胺和萘基乙烯胺的顺序不能颠倒的缘由是什么？