实验五实验五 蛋白质的颜色反响蛋白质的颜色反响及沉淀反响及沉淀反响 蛋白质颜色反响原理蛋白质颜色反响原理 蛋白质分子中的某种或某些基团与显色剂作用，可产生特定的颜色反响。不同蛋白质所含氨基酸不完全一样，颜色反响亦可不同。颜色反响不是蛋白质的专注反响， 一些非蛋白物质亦可产生一样的颜色反响， 因此不能仅根据颜色反响的结果断定被测物能否是蛋白质。颜色反响是一些常用的蛋白质定量测定的根据。常见的蛋白质颜色反响常见的蛋白质颜色反响1. 米伦氏反响米伦氏反响 2. 双缩脲反响双缩脲反响 3. 黄色反响黄色反响 4. 茚三酮反响茚三酮反响 5. 乙醛酸反响乙醛酸反响 一米伦氏一米伦氏MillonMillon反响反响原理：米伦试剂为硝酸、亚硝酸、硝酸汞和亚硝酸汞之混合物，能与苯酚、双酚及某些羟苯衍生物产生颜色反响。这些反响最初产生的有色物质能够为羟苯之亚硝基衍生物，经变位作用变成颜色更深的邻醌肟，最终构成红色稳定产物。组成蛋白质的氨基酸中只需酪氨酸为羟苯衍生物，因此该反响为酪氨酸的显色反响酚羟基反响。本卷须知：加热时容易产生暴沸，要留意平安，应温暖加热。二双缩脲反响二双缩脲反响原理：将尿素加热，两分子尿素放出一分子氨而构成双缩脲。双缩脲在碱性环境中，能与硫酸铜结合成红紫色的络合物，此反响为双缩脲反响。蛋白质分子中含有肽键与缩脲构造类似，故能呈此反响。普通肽键越多颜色越深，而且受蛋白质特异性影响小本卷本卷须知：硫酸知：硫酸铜不能多加，否那么会不能多加，否那么会产生影响察看的生影响察看的蓝色色络离子离子CuCuNH3NH342+42+三黄色反响三黄色反响原理：蛋白质分子中含有苯核构造的氨基酸如酪氨酸、色氨酸等，遇到硝酸可硝化成黄色物质，此物质在碱性环境中变为橘黄色的硝苯衍生物。这是含酪氨酸和色氨酸蛋白质所特有的反响。皮肤、指甲和毛发等遇浓硝酸变黄，缘由在此。四四茚三三酮反响反响原理：蛋白质与茚三酮共热，那么产生蓝色的复原茚三酮、茚三酮和氨的缩合物。此反响为一切蛋白质及氨基酸所共有。本卷本卷须知：反响必知：反响必需在需在pH 5-7pH 5-7进展。展。五乙醛酸反响五乙醛酸反响含色氨酸的蛋白质在浓硫酸中与一些醛类反响含色氨酸的蛋白质在浓硫酸中与一些醛类反响能构成有色物质。此反响可作为色氨酸的定性定量能构成有色物质。此反响可作为色氨酸的定性定量反响。反响。、在蛋白、在蛋白质溶液中参与溶液中参与HCOCOOHHCOCOOH，将，将浓硫酸沿管壁硫酸沿管壁缓慢参与，不使相混，在液慢参与，不使相混，在液面交界面交界处，即有紫色，即有紫色环构成构成、色氨酸的反响、色氨酸的反响吲哚环的反响的反响、鉴定蛋白定蛋白质中能否含有中能否含有色氨酸色氨酸实验步步骤蛋白质沉淀反响原理蛋白质沉淀反响原理 在水溶液中蛋白质分子的外表由于构成水化层和双电层，而成为稳定的胶体颗粒。但这种稳定性是有条件的、相对的。在一定的物理化学要素影响下，蛋白质颗粒失去电荷，脱水，甚至变性而丧失稳定要素，即以固态方式从溶液中析出，这种作用称为蛋白质的沉淀反响。 可逆沉淀反响：在发生沉淀反响时，蛋白质虽已沉淀析出，蛋白质分子内部构造并未发生显著变化，根本上坚持原有的性质。除去沉淀要素后，蛋白质沉淀可再溶于原来的溶剂中。 不可逆沉淀反响：在发生沉淀反响时，蛋白质分子内部构造，特别是天然构造遭到破坏，失去其天然蛋白质的原来性质，这种蛋白质沉淀不能再溶解于原来的溶剂中。常见的蛋白质沉淀反响常见的蛋白质沉淀反响1. 蛋白质盐析作用蛋白质盐析作用 2. 酒精沉淀蛋白质酒精沉淀蛋白质 3. 重金属盐沉淀蛋白质重金属盐沉淀蛋白质4. 生物碱试剂沉淀蛋白质生物碱试剂沉淀蛋白质5. 有机酸沉淀蛋白质有机酸沉淀蛋白质 6. 无机酸沉淀蛋白质无机酸沉淀蛋白质7. 加热沉淀蛋白质加热沉淀蛋白质 一蛋白质盐析作用一蛋白质盐析作用原理：向蛋白质溶液中参与中性盐硫酸铵、硫酸钠或氯原理：向蛋白质溶液中参与中性盐硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等至一定浓度，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。沉淀化钠等至一定浓度，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。沉淀不同的蛋白质所需中性盐的浓度也不同。不同的蛋白质所需中性盐的浓度也不同。本卷须知：、应先加蛋白质溶液，然后加饱和硫酸铵溶液；、固体硫酸铵假设加到过饱和那么有结晶析出，勿与蛋白质沉淀混淆。二酒精沉淀蛋白二酒精沉淀蛋白质原理：酒精原理：酒精为脱水脱水剂，能破坏蛋白，能破坏蛋白质胶体胶体质点的水化点的水化层而而使其沉淀析出。使其沉淀析出。三重金属盐沉淀蛋白质三重金属盐沉淀蛋白质原理：当溶液原理：当溶液PHPH大于等电点时，蛋白质颗粒带负电荷，这大于等电点时，蛋白质颗粒带负电荷，这样它就容易与重金属盐如样它就容易与重金属盐如Cu2+Cu2+、Ag+Ag+、Hg2+Hg2+、Pb2+Pb2+等结合构等结合构成不溶性盐类而沉淀。成不溶性盐类而沉淀。本卷须知：运用乙酸铅或硫酸铜沉淀蛋白质时，试剂不可加过本卷须知：运用乙酸铅或硫酸铜沉淀蛋白质时，试剂不可加过量，否那么可使沉淀出的蛋白质重新溶解。为什么？量，否那么可使沉淀出的蛋白质重新溶解。为什么？四生物碱四生物碱试剂沉淀蛋白沉淀蛋白质原理：植物体内具有原理：植物体内具有显著生理作用的含氮碱性化合物称著生理作用的含氮碱性化合物称为生生物碱。能沉淀生物碱或与其物碱。能沉淀生物碱或与其产生生颜色反响的物色反响的物质称称为生物碱生物碱试剂，如鞣酸、苦味酸、磷如鞣酸、苦味酸、磷钨酸等。当溶液酸等。当溶液PHPH小于等小于等电点点时，蛋白，蛋白质颗粒粒带正正电荷，容易与生物碱荷，容易与生物碱试剂发生反响生成不溶性生反响生成不溶性盐而沉淀。而沉淀。五有机酸沉淀蛋白质五有机酸沉淀蛋白质原理：当溶液原理：当溶液PHPH小于等电点时，蛋白质颗粒带正电荷，容小于等电点时，蛋白质颗粒带正电荷，容易与某些有机酸如三氯乙酸和磺基水杨酸等的酸根负离子发生易与某些有机酸如三氯乙酸和磺基水杨酸等的酸根负离子发生反响生成不溶性盐而沉淀。这个反响可将生物体液中的蛋白质反响生成不溶性盐而沉淀。这个反响可将生物体液中的蛋白质完全去除。完全去除。六无机酸沉淀蛋白六无机酸沉淀蛋白质原理：原理：浓无机酸磷酸除外，能使蛋白无机酸磷酸除外，能使蛋白质发生不可逆的生不可逆的沉淀反响。沉淀反响。这种沉淀作用能种沉淀作用能够是蛋白是蛋白质颗粒脱水的粒脱水的结果。果。七加热沉淀蛋白质七加热沉淀蛋白质原理：几乎一切的蛋白质都因加热变性而凝固，变成不可逆原理：几乎一切的蛋白质都因加热变性而凝固，变成不可逆的不溶形状。盐类和氢离子浓度对蛋白质加热凝固有重要影响。的不溶形状。盐类和氢离子浓度对蛋白质加热凝固有重要影响。少量盐类促进蛋白质的加热凝固。当蛋白质处于等电点时，加热少量盐类促进蛋白质的加热凝固。当蛋白质处于等电点时，加热凝固最完全、最迅速。在酸性或碱性溶液中，蛋白质分子带有正凝固最完全、最迅速。在酸性或碱性溶液中，蛋白质分子带有正电荷或负电荷，虽加热蛋白质也不凝固。假设同时有足量的中性电荷或负电荷，虽加热蛋白质也不凝固。假设同时有足量的中性盐存在，那么蛋白质可因加热而凝固。盐存在，那么蛋白质可因加热而凝固。加热变性引起蛋白质凝固沉淀的原理能够是由于热变性使蛋加热变性引起蛋白质凝固沉淀的原理能够是由于热变性使蛋白质天然构造解体，疏水基外露，因此破坏了水化层，同时由于白质天然构造解体，疏水基外露，因此破坏了水化层，同时由于蛋白质处于等电点也破坏了带电形状。蛋白质处于等电点也破坏了带电形状。实验本卷须知实验本卷须知1. 实验中运用的试剂种类繁多，留意防止所运用试剂的交叉污染。2. 留意滴管的正确运用，防止酸、碱或有机试剂污染滴头。3. 在实验中，特别是酒精灯加热过程中要留意操作规范，留意实验平安.双缩脲反响时试管口对着墙。4.除取蛋清液外，其他都用滴管取液,大致估算体积.5.实验报告中留意解释各种景象和讲义中提出的问题。思索题思索题请说出在上述蛋白质沉淀反响中，哪些为请说出在上述蛋白质沉淀反响中，哪些为可逆沉淀，哪些为不可逆沉淀？可逆沉淀，哪些为不可逆沉淀？