第十三章 毛细管电泳 （ Capillary Electrophoresis， CE ）第一节 概述 早在一百多年以前，较原始的电泳实验，是在一个U形一管中进行的，管中盛有溶液，两端置有电极，加上几百伏电压后，首次实验了对毒素和抗毒素的分离。1909年，L.Michaelis提出“电泳”这一术语，他的实验是用于测定蛋白质的等电点。 此后，许多的研究报告涉及氨基酸、肽类、蛋白质的分离。为了防止电泳完成了的溶液中，再次发生对流混合，曾使用了各种稳定介质，如琼脂、纤维粉、玻璃丝、硅胶及丙烯酸胺； 为了防止热扩散而使用了一种内径小的管道，管道内径由3mm缩小至75m。1981年，Jorgenson和Lukacs 使用75m内径的熔融石英毛细管，电泳分离氨基酸和肽。至此，出现了毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）技术。 毛细管电泳，又称高效毛细管电泳（High Performance capillary electrophoresis，HPCE），它不同于经典的区带电泳，有如下特点： （1）它是在内径（10200）m的石英毛细管中进行的，在毛细管中的散热较好，沿着管截面的温度梯度很小，因此，可以提高加在毛细管两端的电压，所加电压可高达几十千伏。 （2）它不需要阻流介质，但可使用凝胶作分子筛介质。 （3）可使用在柱检测法，缩短分析时间，结合计算机处理数据，可实现自动化操作。 （4）灵敏度高，检测限可达（10-1310-15）mol，使用激光诱导的荧光检测限可达（10-1910-21）mol。 （5）分辨率高，理论塔板数为几十万至几百万米。 （6）取样量少，有时只需几个纳升（nL，10-9L），流动相只需几毫升。 第二节 高效毛细管电泳的基本原理溶质在毛细管区带电泳过程中的传递 含离子的溶液，在电场中所发生的物理过程服从欧姆定律，当有直流电通过溶液时，阴离子向阳极迁极，阳离子向阴极迁移，溶液的导电率取决于离于浓度和其迁移率(又称淌度，即指溶质在单位时间和单位电场强度下移动的距离)。离子迁移率以表示，其大小受溶质的电荷离子大小比例所控制。 在电场的影响下，带电荷的质点受到的力Fe，等于其净电荷q与电场强度E的乘积，即Fe = qE。电场强度E以每单位长度所加的电压U来表示，即E=U/L，其中L是毛细管长度。Fe对正电荷为正值，对负电行为负值。 电场力促使带电质点向两极移动，质点在移动过程中，也受到一种与电场力方向相反的阻滞力Fd，阻止其移动，此阻滞力与质点的电泳速度成正比，由下式结出 Fd =f 式中，f是质点平移动所受的摩擦阻力，对小的球状物质点，可用斯托克斯（Stokes）定律表示，即： f=6r 式中，是溶液的粘度，r是离子半径。即摩擦阻力正比于溶液的粘度、质点大小和其电泳速度。由于存在摩擦阻力，一种带电质点在电场中运动，被加速到一有限速度，此速度取决于Fe和Fd，这一有限速度称为电泳速度，ep 。当促进力与阻滞力达到平衡时，则 ep qEf 将上述表达式合并，作为电泳迁移率（或电泳淌度）ep 。表示式，则 epepEq士6r 电泳迁移率定义为：一种质点在每单位电场强度下的稳态速度。 ep 值的大小，取决于分子的净电荷数及其摩擦性质，（分子大小和形状）以及所用介质的介电常数和粘度。因而，对于每一种质点，在电场作用下的迁移均具有特定的速度。 对于大分子或胶体，其关系可表示为 HPCE分离，几乎都是在熔融石英毛细管中完成的，熔融石英是一种高度交联的SiO2聚合物，具有很好的抗拉强度。石英毛细管表面含有许多硅酸基（SiOH），在一定的条件下可离解。使表面带有负电荷。 由于表面带负电，因此，带负电荷的离子被表面排斥，而带正电均离子则被毛细管壁吸引。 在毛细管壁的阴离子，与来自主体溶液中的阳离子在石英一溶液界面上形成双电层。由于静电场的作用，靠近表面的那些抗衡离子是不迁移的，因此构成所谓稠密层。 由于热运动关系，离表面远的离子构成可迁移层或扩散层，因为在双电层内离子的立体分布，就形成一种电势梯度. 当在毛细管两端加有电场时；扩散层内可迁移的阳离子向阴极移动。由于离子是被水化的，因此，在缓冲液中的液体也随迁移着的阳离子一道，向阴极移动，形成一种液流，称之为电渗流（electroosmotic flow，EOF），它是一种电泳驱动力。在双电层内，EOF总是向双电层内抗衡离子方向迁移，穿过双电层的电势下降的程度受电渗流速度所控制。电渗流的线速度eo ，可以定义为： Zeta电势可表示为： =4/ 式中，是毛细管表面电荷密度；为双电层厚度。按近代电解质理论，等于1K，因此式可写为：第三节第三节 在在CZECZE分离中的迁移时间、效率及分辨分离中的迁移时间、效率及分辨率率 在电渗流存在下，离子的迁移速度可表示为： =（eo）U/Lt 式中，Ld是毛细管总长度；U是外加电压。离子的迁移时间为t，则 t=LtLd/（eo）U 式中，Lt为进样端到检测器之间的毛细管长度，或称为迁移长度。分离效率n可表示为 式中，D为溶质的平均扩散系数。由上式可见，如果热影响阿忽略不计的话，增大电压，可增加分离效 率。 按Gidding方程5，分辨率R只可定义为1和2两溶质的电泳迁移率，而是它们的平均电泳迁移率。 在许多情况下，电渗流速度比许多质点的电泳速度要快，因此，在毛细管中的所有溶质将朝一个方向迁移，不管它们带多少正电荷，都将先被检出，继之中性质点被检出，最后带负电荷的质点被检出。如下图所示。第四节第四节 HPCEHPCE仪器的基本结构仪器的基本结构 HPCE仪器的基本结构如下页图所示。充满缓冲液的毛细管，两端分别浸入盛有缓冲液的储瓶中，之后通以30kV的电压，整个带电管路置于一个安全保护盒内以防高压危险，打开有机玻璃盒时即自动切断电源。 待测组分从毛细管的一端引人，在电场作用下，由于离子迁移速度有差别，而在整个毛细管内形成不同的样品区带，在毛细管的另一端放置检测器，以便连续地检测流过的每一个组分带，分析信号通过检测器接收后。经放大再输入计算机系统进行数据处理与储存。