实验三实验三 DNA片段的衔接片段的衔接 向质粒载体中插入外源向质粒载体中插入外源DNA片段片段 实验目的实验目的 : 了解了解DNA片段衔接的原片段衔接的原理，掌握理，掌握DNA衔接的方法。衔接的方法。 实验原理实验原理 : DNA片段之间的衔接主片段之间的衔接主要是在要是在DNA衔接酶的作用下，使衔接酶的作用下，使DNA裂口上核苷酸裸露的裂口上核苷酸裸露的3羟基和羟基和5磷酸之间构成共价结合的磷酸二磷酸之间构成共价结合的磷酸二酯键，使原来断开的酯键，使原来断开的DNA裂口衔接裂口衔接起来。起来。 实验仪器、器、资料与料与试剂 一一仪器器 1. 1. 恒温水浴恒温水浴锅或恒温箱或恒温箱 2. 2. 微量取液器微量取液器 二二资料料 “ “实验二二 回收的回收的DNADNA片段片段三三试剂 试剂盒所盒所带：Solution I (TaKaRa)Solution I (TaKaRa)实验步步骤 参与参与pMD18-T VectorpMD18-T Vector约0.03pmol0.03pmol，质粒粒载体体DNADNA1L1L，及上个，及上个实验回收的回收的DNADNA约0.10.10.3pmol0.3pmol，插入片段的，插入片段的DNADNA溶液溶液TETE缓冲液或去离子水冲液或去离子水4L4L，总体体积为5L5L。 参与与参与与DNADNA溶液等量的溶液等量的Solution ISolution I其中其中包括包括衔接接酶、BufferBuffer、双蒸水、双蒸水5L5L。 混合均匀后混合均匀后,3000-4000rpm ,3000-4000rpm 离心离心20-3020-30秒；秒；最好再混合并离心一次。最好再混合并离心一次。1616下下衔接接4545分分钟至至1 1小小时。 放于放于-20-20冰箱中，用于下次冰箱中，用于下次实验的的转化。化。当直接当直接进展展转化化时，取上述，取上述衔接反响液接反响液10L 10L 转化至化至100-200L100-200L的感受的感受态细胞。胞。 pMD18-T Vector T-载体衔接酶：把基因缝在一同衔接酶：把基因缝在一同本卷本卷须知知回收的回收的PCRPCR产物、物、载体以及体以及SolutionISolutionI组成的成的10L10L反响体系需充分混匀。反响体系需充分混匀。在取在取SolutionISolutionI时，应使之不分开冰盒，使之不分开冰盒，以防以防酶活性的破坏。活性的破坏。假假设反响温度升高反响温度升高2626，较难构成构成环状状DNADNA。因此反响必需于。因此反响必需于1616进展。展。 当当衔接反响接反响难以以进展展时，可以适当延伸，可以适当延伸反响反响时间。当。当衔接效率依然无所改接效率依然无所改动时，可可对DNADNA进展乙醇沉淀从而展乙醇沉淀从而浓缩后再反后再反响。响。n n衔接反响液可以直接用于转化，如发现转化效率偏低时，反响终了后向反响液中添加NaCl使其终浓度为500mM，然后进展转化，可改善转化效率。n n另外，当转化DNA量较大或者利用电刺激转化时，先用乙醇沉淀法精制DNA。 载体构造的三大要素：体构造的三大要素： 多克隆位点多克隆位点 选择标志耐志耐药性，性，LacZ 独立的复制独立的复制单位位载体种体种类： 质粒粒 噬菌体噬菌体 酵母人工染色体酵母人工染色体YAC 反反转录病毒病毒载体体 表达表达载体等体等