病毒载体研究进展病毒载体研究进展基因载体系统基因载体系统病毒载体系统病毒载体系统非病毒载体系统非病毒载体系统腺腺病病毒毒载载体体反反转转录录病病毒毒载载体体腺腺伴伴随随病病毒毒载载体体单单纯纯疱疱疹疹病病毒毒载载体体慢慢病病毒毒载载体体裸裸D DN NA AD DN NA A- -阳阳离离子子脂脂质质复复合合物物D DN NA A- -蛋蛋白白质质复复合合物物细胞内包装细胞内包装细胞外包装细胞外包装D DN NA A- -阳阳离离子子多多聚聚物物D DN NA A/ /R RN NA A嵌嵌合合物物吴小兵吴小兵（863计划生物领域病毒基因载体研发基地）计划生物领域病毒基因载体研发基地）病毒载体概述（病毒载体概述（1）要求：要求：1 1、携带外源基因并能包装成感染性病毒颗粒、携带外源基因并能包装成感染性病毒颗粒 2 2、介导外源基因转移和表达、介导外源基因转移和表达 3 3、对机体不致病、对机体不致病容量：容量：自身基因组大小的自身基因组大小的105%110105%110% 类型：类型：1 1、重组型病毒载体、重组型病毒载体 2 2、无病毒基因的病毒载体、无病毒基因的病毒载体 复制缺陷型复制缺陷型 可复制型可复制型 复制缺陷型复制缺陷型组成：组成：1 1、病毒复制和包装元件、病毒复制和包装元件 2 2、病毒基因、病毒基因 3 3、插入的外源基因或元件、插入的外源基因或元件 4 4、病毒外壳、病毒外壳/ /外膜外膜 用途：基因转移和表达用途：基因转移和表达 1、基因治疗、基因治疗 2、疫苗、疫苗 3、器官移植、器官移植 4、组织工程、组织工程 5、转基因动物、转基因动物 6、基因功能研究、基因功能研究 病毒载体概述（病毒载体概述（2）优点：优点：1 1、利用病毒天然的感染性进入细胞，转导效率高；、利用病毒天然的感染性进入细胞，转导效率高； 2 2、复杂的装配过程由细胞完成；、复杂的装配过程由细胞完成； 3 3、不同的病毒载体具有不同的表达特点、不同的病毒载体具有不同的表达特点。存在的问题：存在的问题：1 1、安全性、安全性2 2、靶向性、靶向性3 3、有效性、有效性细胞毒性细胞毒性染色体毒性染色体毒性免疫毒性免疫毒性转导靶向性转导靶向性转录靶向性转录靶向性转导效率转导效率靶向性靶向性基因表达水平和持续时间基因表达水平和持续时间表达的可调控性表达的可调控性常用的病毒载体的特点：常用的病毒载体的特点：病毒载体研究方向病毒载体研究方向1、病毒包装系统、病毒包装系统 2、无病毒基因的病毒载体、无病毒基因的病毒载体6、自我扩增型病毒载体、自我扩增型病毒载体7、条件增殖型病毒载体、条件增殖型病毒载体5、嵌合型病毒载体、嵌合型病毒载体3、靶向性病毒载体、靶向性病毒载体4、可调控表达的病毒载体、可调控表达的病毒载体8、新病毒载体、新病毒载体病毒载体包装系统病毒载体包装系统组成：组成：1、宿主细胞、宿主细胞 2、辅助元件（辅助质粒、辅助病毒）、辅助元件（辅助质粒、辅助病毒） 3、被包装的、被包装的DNA/RNA 包含顺式作用元件包含顺式作用元件 单因素生产系统（单因素生产系统（one-component system)双因素生产系统双因素生产系统 (two-component system) gag pol envLTRLTR 图图1 反转录病毒包装系统示意图反转录病毒包装系统示意图图图2 腺病毒包装系统示意图腺病毒包装系统示意图 293 cellE1a,bJM17Ad Shuttle 293 cellE1a,b多因素生产系统多因素生产系统 (multi-component system)多因素系统多因素系统 双因素系统双因素系统图图3 腺病毒伴随病毒包装系统示意图腺病毒伴随病毒包装系统示意图host cellHelper virusHelper plasmidrep cap Vector plasmidHost cell +vector DNAHelper virus +helper plasmid图图4 双因素系统生产重组双因素系统生产重组AAV病毒示意图病毒示意图proviral cellRecombinant helper virus(rHSV-repcap)rep cap 无病毒基因的病毒载体无病毒基因的病毒载体被包装的被包装的DNA/RNA中不含任何病毒编码基因，只保留其复制和中不含任何病毒编码基因，只保留其复制和包装所必需的顺式作用元件。获得的重组病毒颗粒具有野生型病包装所必需的顺式作用元件。获得的重组病毒颗粒具有野生型病毒的外壳毒的外壳/外膜和感染性，但不表达病毒蛋白。外膜和感染性，但不表达病毒蛋白。腺伴随病毒载体：腺伴随病毒载体：反转录病毒载体：反转录病毒载体：腺病毒载体：腺病毒载体：单纯疱疹病毒载体：单纯疱疹病毒载体：LTRLTR genegeneITRITRpAgeneITRITRpAgenepacorigenegenegenegene无辅助病毒包装系统无辅助病毒包装系统图图5 重组重组AAV无辅毒包装系统无辅毒包装系统adenovirusgeneITRITRaav vector plasmidE2a E4orf6 VA Helper plasmid:293细胞细胞E1a,bcre293-cregeneITRITRAdenovirus with packaging signal flanked by loxP 图图6 mini-adnovirus无辅毒包装系统无辅毒包装系统靶向性病毒载体靶向性病毒载体转导靶向性转导靶向性转录靶向性（特异性）转录靶向性（特异性）改造病毒外壳改造病毒外壳/外膜外膜连接靶向性结合分子连接靶向性结合分子Modified adenoviruscell组组织织特特异异性性启启动动子子肿肿瘤瘤选选择择性性启启动动子子细细胞胞周周期期调调控控启启动动子子肿肿瘤瘤血血管管内内皮皮导导向向启启动动子子双双特特异异性性启启动动子子病病毒毒增增殖殖的的特特异异性性转转录录调调控控可调控表达的病毒载体可调控表达的病毒载体细胞的调控元件细胞的调控元件病毒的调控元件病毒的调控元件人工合成的调控元件人工合成的调控元件细胞特异性转录细胞特异性转录细胞启动子细胞启动子 病毒启动子病毒启动子albumin MVM P4Tyrosinase or TRP-1 B19 promoterPSA HBVMBP JCV MCK EBVGFAP NSE KDR/flt-1AFPCEAerbB2HREMDR1P1tTAtetOpgeneP1tTAtetOpgenetTAtetOpgenetetOp四环素调控四环素调控合成的转录因子合成的转录因子GAL4PRVP16RXREcRVP16FKB12ZFHD-1FRAPP65rapamycinRU486GAL4ERVP16ESTRADIOLGAL4ERp65Diphenol indenemuristerone重组病毒的生产和纯化重组病毒的生产和纯化小量制备和纯化小量制备和纯化大量制备和纯化大量制备和纯化场所场所细胞培养细胞培养细胞裂解细胞裂解病毒分离病毒分离病毒纯化病毒纯化制剂制剂保存保存培养瓶培养瓶 转瓶、细胞工厂、发酵罐转瓶、细胞工厂、发酵罐反复冻融反复冻融 机械法或化学法裂解机械法或化学法裂解 实验室实验室 中试车间中试车间 离心离心 离心、超滤、萃取离心、超滤、萃取密度梯度超速离心密度梯度超速离心 浓缩、柱层析浓缩、柱层析配方配方缓冲液缓冲液低温低温病毒载体与基因治疗产业化病毒载体与基因治疗产业化基因治疗产品的知识产权构成基因治疗产品的知识产权构成 1、治疗基因2、调控元件3、改造的外壳/外膜4、靶向分子5、包装系统6、生产和纯化技术7、制剂和保存技术产业化的组织和实施：产业化的组织和实施： 1、合作开发2、专业分工3、政府支持和企业投资4、利益分配基因治疗的三个核心部分基因治疗的三个核心部分 1、基因载体系统2、基因表达系统3、治疗基因知识产权和基础研究知识产权和基础研究专利对学术研究的影响专利对学术研究的影响1、无影响（对非常早期研究）、无影响（对非常早期研究）2、有影响（对临床试验和可能的商业开发）、有影响（对临床试验和可能的商业开发）基因治疗领域的知识产权主要通过专利系统来保护基因治疗领域的知识产权主要通过专利系统来保护对于基因治疗公司最重要的专利是对于基因治疗公司最重要的专利是：1、载体系统；、载体系统； 2、生产过程；、生产过程；3、整体治疗方案、整体治疗方案 治疗基因和表达系统可以从其它方购买使用权。治疗基因和表达系统可以从其它方购买使用权。 政府支持对基因治疗产业化的重要作用政府支持对基因治疗产业化的重要作用1、政策上促进基因治疗的科研、临床和商业开发、政策上促进基因治疗的科研、临床和商业开发2、资助基因治疗核心技术研究和开发、资助基因治疗核心技术研究和开发3、资助建立能规模化生产临床级基因载体的中心或基地、资助建立能规模化生产临床级基因载体的中心或基地4、支持从事基因治疗的公司发展新技术、新产品、支持从事基因治疗的公司发展新技术、新产品5、促进新的基因治疗公司建立。、促进新的基因治疗公司建立。6、制定规范、高效且符合国情的审批程序。、制定规范、高效且符合国情的审批程序。