1-1DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具1.一、基因工程的概念一、基因工程的概念基因工程是指按照基因工程是指按照，进行严格的，进行严格的设计，并通过设计，并通过和和技术，赋技术，赋予生物以新的予生物以新的，从而创造出更符合人，从而创造出更符合人们需要的新的们需要的新的和和。基因工程的别名基因工程的别名操作环境操作环境操作对象操作对象操作水平操作水平基本过程基本过程结果结果DNA重组技术重组技术生物体外生物体外基因基因DNA分子水平分子水平获取基因获取基因体外重组体外重组导入基因导入基因表达基因表达基因人类需要的新的生物类型和生物产品人类需要的新的生物类型和生物产品人们的意愿人们的意愿DNA重组重组转基因转基因遗传特性遗传特性生物类型生物类型生物产品生物产品2.二、二、DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶“分子手术刀分子手术刀”DNA连接酶连接酶“分子缝合针分子缝合针”载体载体“分子运输车分子运输车”3.识别某种双链识别某种双链DNA分子分子特定的核苷特定的核苷酸序列酸序列，并使每一条链中，并使每一条链中特定部位特定部位的的两个核苷酸之间的两个核苷酸之间的磷酸二酯键磷酸二酯键断开断开。主要主要是从是从原核生物原核生物中分离纯化而来中分离纯化而来1、来源：、来源：2、作用：、作用：3、特点：、特点：4、结果：、结果：片段的末端的形式片段的末端的形式黏性黏性末端末端平平末端末端(一）限制性核酸内切酶（限制酶）一）限制性核酸内切酶（限制酶）-“分子手分子手术刀术刀”特异性特异性-特定序列、特定位点特定序列、特定位点形成形成DNA的的双链片段双链片段4.（二）（二）DNA连接酶连接酶-“分子缝合针分子缝合针”1、种类：、种类：2、作用部位：、作用部位：两类两类EcoliDNA连接酶连接酶:连接连接黏性末端黏性末端T4DNA连接酶连接酶：连接连接黏性末端黏性末端和和平末端平末端磷酸二酯键磷酸二酯键5.2、运载体必须具备的条件：、运载体必须具备的条件：（1）具有具有一个或多个一个或多个限制酶切点限制酶切点，以便与目的基因连接；，以便与目的基因连接；（2）能够能够在受体细胞中在受体细胞中复制并稳定地保存复制并稳定地保存，以便目的基，以便目的基因的遗传；因的遗传；（3）具有具有某些某些标记基因标记基因，以便进行重组，以便进行重组DNA的筛选。的筛选。（如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因（如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等等）；）；（4）对受体细胞）对受体细胞无害无害；（5）大小合适大小合适，以便提取和体外操作。，以便提取和体外操作。1、运载体的作用：、运载体的作用：（1）将目的基因转移到受体细胞中去；）将目的基因转移到受体细胞中去；（2）使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传；）使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传；（3）使目的基因能够表达和发挥作用。）使目的基因能够表达和发挥作用。（三）（三）运载体运载体-“分子运输车分子运输车”6.质粒是基因工程最质粒是基因工程最常用的运载体，它广泛常用的运载体，它广泛地存在于细菌中，是细地存在于细菌中，是细菌拟核菌拟核DNA外能够外能够自主自主复制复制的的很小很小的的环状环状DNA分子分子，大小只有普通细，大小只有普通细菌拟核菌拟核DNA的百分之一。的百分之一。要对天然质粒进行人工改造要对天然质粒进行人工改造常用的运载体有：常用的运载体有：质粒质粒，噬菌体的衍生物，噬菌体的衍生物，动植物病毒动植物病毒等等7.1.以下说法正确的是（以下说法正确的是（）A、所所有有的的限限制制酶酶只只识识别别一一种种特特定定的的核核苷苷酸酸序序列列B、质粒是基因工程中唯一的运载体、质粒是基因工程中唯一的运载体C、运运载载体体必必须须具具备备的的条条件件之之一一是是：具具有有一一个个或多个限制酶切点，以便与外源基因连接或多个限制酶切点，以便与外源基因连接D、DNA连连接接酶酶使使黏黏性性末末段段的的碱碱基基之之间间形形成成氢键氢键C练习练习8.2.不不属属于于质质粒粒被被选选为为基基因因运运载载体体的的理理由由是是（）A、能复制、能复制B、有多个限制酶切点、有多个限制酶切点C、具有标记基因、具有标记基因D、它是环状、它是环状DNAD练习练习9.3.有关基因工程的叙述中，错误的是（有关基因工程的叙述中，错误的是（）A、基基因因工工程程技技术术能能定定向向地地改改造造生生物物的的遗遗传传性性状，培育生物新品种状，培育生物新品种B、重组、重组DNA的形成在生物体外完成的形成在生物体外完成C、目的基因须由运载体导入受体细胞、目的基因须由运载体导入受体细胞D、质粒都可作为运载体、质粒都可作为运载体D练习练习10.练习练习CTGCAGGACGTCACTGGCCGGCTTAAGCCGGTCAAATTCG11.2.2基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序第第5章章生态系统及其稳定性生态系统及其稳定性12.基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：1、；2、；3、；4、。其中核心是其中核心是。目的基因的获取目的基因的获取基因表达载体的构建基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定基因表达载体的构建基因表达载体的构建13.一、获取目的基因一、获取目的基因1、目的基因：在基因操作中使用的外源基因。它、目的基因：在基因操作中使用的外源基因。它主要是主要是的基因，也可以是一些具有调的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。控作用的因子。编码蛋白质编码蛋白质14.一、获取目的基因一、获取目的基因2、获取方法：、获取方法：（1）从基因文库中获取）从基因文库中获取基因文库：将含有某种生物基因文库：将含有某种生物不同基因不同基因的许多的许多DNA片片段，段，导入导入到到受体菌的群体受体菌的群体中储存，各个受体菌分别中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为含有这种生物的不同基因，称为基因文库。基因文库。基因文库基因文库基因组文库基因组文库-包含一种生物的所有基因包含一种生物的所有基因部分基因文库部分基因文库-包含一种生物的部分基因包含一种生物的部分基因（如（如cDNA文库）文库）15.一、获取目的基因一、获取目的基因2、获取方法：、获取方法：（1）从基因文库中获取）从基因文库中获取基因组文库和基因组文库和cDNA文库的构建和比较文库的构建和比较16.一、获取目的基因一、获取目的基因2、获取方法：、获取方法：（1）从基因文库中获取）从基因文库中获取从构建好的基因文库中获取目的基因：从构建好的基因文库中获取目的基因：依据基因的依据基因的核苷酸序列核苷酸序列、基因的、基因的功能功能、基因基因在染色体上的位置在染色体上的位置、基因的、基因的转录产物转录产物mRNA，以及基因的，以及基因的表达产物蛋白质表达产物蛋白质等特等特性来获取目的基因。性来获取目的基因。17.一、获取目的基因一、获取目的基因2、获取方法：、获取方法：（2）用）用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因PCR技术：在生物技术：在生物复制特定复制特定的的核酸合成技术。核酸合成技术。体外体外DNA片段片段PCR技术原理：技术原理：。DNA双链复制双链复制18.55-60：与单链模板相应互补序列结合；与单链模板相应互补序列结合；一、获取目的基因一、获取目的基因2、获取方法：、获取方法：（2）用）用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因90-95：目的基因的双链模板在热力作用下，：目的基因的双链模板在热力作用下，断裂，形成单链断裂，形成单链DNA;氢键氢键引物引物过程：过程：70-75：在：在作用下进作用下进行延伸。行延伸。DNA聚合酶（聚合酶（Taq酶）酶）19.一、获取目的基因一、获取目的基因2、获取方法：、获取方法：（2）用）用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因PCR技术的条件：技术的条件：模板模板：原料原料：引物引物：酶酶：温度控制：温度控制：目的基因目的基因两条链两条链四种游离的四种游离的脱氧核苷酸脱氧核苷酸（一小段与目的基因模板链互补的）一对（一小段与目的基因模板链互补的）一对DNA单链单链热稳定热稳定DNA聚合酶聚合酶（Taq酶）酶）高温高温低温低温中温中温20.一、获取目的基因一、获取目的基因2、获取方法：、获取方法：（2）用）用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因PCR结果：结果：使目的基因以使目的基因以形式在短时间内大形式在短时间内大量扩增。量扩增。指数指数21.一、获取目的基因一、获取目的基因2、获取方法：、获取方法：（3）用化学方法人工合成）用化学方法人工合成如果基因比较小，如果基因比较小，又已知，可以又已知，可以通过通过用化学方法直接人工合成用化学方法直接人工合成核苷酸序列核苷酸序列DNA合成仪合成仪22.二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建1、目的：、目的：（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以）使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以给下一代；给下一代；（2）使目的基因能够）使目的基因能够和发挥作用和发挥作用遗传遗传表达表达23.二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建2、过程：、过程：载体载体目的基因目的基因同一种同一种限制酶限制酶具有黏性末具有黏性末端的载体端的载体具有具有相同相同黏性末黏性末端的目的基因端的目的基因重组重组DNA分子分子DNA连接酶连接酶（重组载体）（重组载体）24.二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建3、组成：、组成：启动子启动子+目的基因目的基因+终止子终止子+标记基因标记基因+(复制原点）复制原点）25.三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞1、转化的概念、转化的概念2、转化的方法、转化的方法植物：植物：农杆菌转化法农杆菌转化法、基因枪法基因枪法、花粉管通道法花粉管通道法动物：动物：显微注射技术显微注射技术微生物：微生物：Ca2+处理法处理法此外此外还有还有3、转化的受体细胞、转化的受体细胞植物：常用植物：常用体细胞体细胞动物：动物：受精卵受精卵微生物：常用大肠杆菌、酵母菌等微生物：常用大肠杆菌、酵母菌等26.四、目的基因的表达和鉴定四、目的基因的表达和鉴定1、导入的鉴定：、导入的鉴定：DNA分子杂交技术分子杂交技术2、转录的鉴定：核酸、转录的鉴定：核酸分子杂交技术分子杂交技术3、翻译的鉴定：、翻译的鉴定：抗原抗原-抗体杂交技术抗体杂交技术4、个体水平的鉴定：抗虫、抗病等的感染、个体水平的鉴定：抗虫、抗病等的感染、接种实验接种实验分子分子水平水平鉴定鉴定27.28. T磷磷酸酸二二酯酯键键 A29.大肠杆菌大肠杆菌(EcoRI)的一种限制酶能识别的一种限制酶能识别GAATTC序列，序列，并在并在G和和A之间切开。之间切开。限制酶所识别的序列有什么特点限制酶所识别的序列有什么特点?限制酶所识别的序列，无论是限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是个碱基还是4个、个、8个个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。上的碱基是反向对称重复排列的。30.黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端：黏性末端：被限制酶切开的被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对正好互补配对，这样，这样的切口叫的切口叫黏性黏性末端。末端。31.平末端：平末端：当限制酶从识别当限制酶从识别序列的中心轴线处切开序列的中心轴线处切开时，时，切开的切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫叫平末端平末端。32.。当限制酶从识别序列的当限制酶从识别序列的中心轴线两侧中心轴线两侧切开时，产生切开时，产生的是的是黏性末端。黏性末端。当限制酶从识别序列的当限制酶从识别序列的中心轴线处中心轴线处切开时，产生的是切开时，产生的是平末端平末端33.能带着插入的目能带着插入的目的基因一起复制的基因一起复制有切割位点有切割位点标记基因的作用鉴标记基因的作用鉴别受体细胞中是否别受体细胞中是否含目的基因。如将含目的基因。如将来可用含青霉素的来可用含青霉素的培养基鉴别，将含培养基鉴别，将含目的基因的细胞筛目的基因的细胞筛选出来。选出来。34.PCR技术技术聚合酶链式反应聚合酶链式反应概念：概念：原理：原理：前提：前提：PCR扩增仪扩增仪DNA双链复制的基本原理双链复制的基本原理一段已知的目的基因的核苷酸序列一段已知的目的基因的核苷酸序列是一项在生物是一项在生物体外体外复制复制特定特定DNA片段片段的核酸合成技术的核酸合成技术35.四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物一对引物热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶(Taq(Taq酶）酶）模板模板DNA (DNA (含有目的基因含有目的基因) )温度控制温度控制条件：条件：方式：以方式：以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增循为扩增循 环的次数）环的次数）结果：结果：目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增指数指数2 2n n36.过程：过程：a a、DNADNA变性（变性（90-9690-96）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、退火（、退火（复性复性55-6055-60）：系统温度降低，引）：系统温度降低，引 物与物与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。 c c、延伸（、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，从酶的作用下，从 引物的引物的55端端33端延伸，合成与模板互补端延伸，合成与模板互补 的的_。 氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链37.复制原点复制原点+ +启动子启动子+ +目的基因目的基因+ +终止子终止子+ +标记基因标记基因重组（基因表达）载体的结构组成重组（基因表达）载体的结构组成38.启动子：启动子：位于基因的首端的一段特殊的位于基因的首端的一段特殊的DNADNA片断，片断，它是它是RNARNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出驱动基因转录出mRNAmRNA，最终获得蛋白质，最终获得蛋白质终止子：终止子：位于基因的尾端的一段特殊的位于基因的尾端的一段特殊的DNADNA片断，片断，能终止能终止mRNAmRNA的转录的转录标记基因标记基因的作用是的作用是为了为了鉴别鉴别受体细胞中是否含有受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来39.限制酶在原核生物中的作用 原核生物容易受到自然界外源原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，的入侵，但是，生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用侵入时，会利用限制酶将外源限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。使之失效，从而达到保护自身的目的。含有某种限制酶的细胞，其含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。能将其切开。 40.基因工程培育抗虫棉的简要过程：基因工程培育抗虫棉的简要过程：普通棉花普通棉花( (无抗虫基因无抗虫基因) )苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌提取提取提取提取抗虫基因抗虫基因与运载体与运载体与运载体与运载体DNADNA拼接拼接拼接拼接导入导入导入导入棉花细胞棉花细胞( (含抗虫基因含抗虫基因) )转基因棉花植株转基因棉花植株41.基因工程操作的四个基本步骤基因工程操作的四个基本步骤1）目的基因的获取）目的基因的获取2）基因表达载体的构建基因表达载体的构建3）将目的基因导入受体细胞）将目的基因导入受体细胞4）目的基因的检测和鉴定）目的基因的检测和鉴定42.基础理论和技术的发展催生了基因工程基础理论和技术的发展催生了基因工程DNA是遗传物质的证明是遗传物质的证明DNA双螺旋结构和中心法则的确立双螺旋结构和中心法则的确立遗传密码的破译遗传密码的破译基因转移载体的发现基因转移载体的发现工具酶的发现工具酶的发现DNA合成和测序技术的发明合成和测序技术的发明DNA体外重组的实现体外重组的实现重组重组DNA表达实验的成功表达实验的成功第一例转基因动物问世第一例转基因动物问世PCR技术的发明技术的发明基础理论基础理论技术发明技术发明43.