细菌的分离、培养与鉴定王欣欣一、细菌的分离一、细菌的分离 1、从混杂微生物中获得单一菌株纯培养的方法称为分离。 2、分离的目的在于从被检材料中、或者从污染的众多杂菌中分离出纯的病原菌。1)病料采集 病料：疑似细菌性疾病的水产养殖动物 以鱼为例，常见症状：体色发黑，体表溃烂、充血、粘液增多，鳃、鳍破损，内脏红肿，腹水，眼球凸出或浑浊，肛门红肿等等。n n活体病料应考虑病原在疾病发展过程中的部位（上述症状）n n病料死后应立即采集，越早越好鱼的解剖结构： 2）无菌操作n n无菌操作是指在环境中一切有生命活动的微生物的无菌操作是指在环境中一切有生命活动的微生物的营养细胞及其芽孢或孢子都不存在的状态。微生物营养细胞及其芽孢或孢子都不存在的状态。微生物研究过程中，既要避免各种外界的微生物进入操作研究过程中，既要避免各种外界的微生物进入操作对象又要杜绝操作对象污染周围环境的操作技术。对象又要杜绝操作对象污染周围环境的操作技术。n n无菌操作是对微生物学工作者最基本的要求，必须无菌操作是对微生物学工作者最基本的要求，必须经过严格训练才能形成无菌操作素养。不论何种情经过严格训练才能形成无菌操作素养。不论何种情况下，头脑中都应该有这个概念。况下，头脑中都应该有这个概念。n n无菌操作贯穿于整个分离过程，例如：病料的采集、无菌操作贯穿于整个分离过程，例如：病料的采集、器材的准备、具体的操作。所用器械及物品均应事器材的准备、具体的操作。所用器械及物品均应事先灭菌备用，金属器具包装后高压灭菌或煮沸先灭菌备用，金属器具包装后高压灭菌或煮沸30min30min，玻璃器皿可高压灭菌也可干热灭菌，胶皮，玻璃器皿可高压灭菌也可干热灭菌，胶皮塞、培养基等则要高压灭菌。塞、培养基等则要高压灭菌。3）细菌分离工具：接种环（接种前后都要严格过火灭菌）工具：接种环（接种前后都要严格过火灭菌）接种环境：无菌操作台接种环境：无菌操作台接种方法：平板划线接种方法：平板划线 * * 以左手持平板，中指、无名指和小指托着平板底以左手持平板，中指、无名指和小指托着平板底, ,拇指和食指打开上盖，使拇指和食指打开上盖，使盖与底成盖与底成3030角，以便划线。角，以便划线。 * * 右手握接种环，先灭菌铂丝部分，待丝烧红后，再于火焰上灭菌金属棒部右手握接种环，先灭菌铂丝部分，待丝烧红后，再于火焰上灭菌金属棒部分。把接种环上的病料涂在培养基一侧，一般作分。把接种环上的病料涂在培养基一侧，一般作5-85-8次划线。将环上的多余细次划线。将环上的多余细菌材料烧掉后，从第菌材料烧掉后，从第1 1次划线引出第次划线引出第2 2次划线；再从第次划线；再从第2 2次划线引出第次划线引出第3 3次划线，次划线，如此反复如此反复3-43-4次划线后，即可把整个平板表面划满，注意每一次划线只能与上次划线后，即可把整个平板表面划满，注意每一次划线只能与上一次划线重叠，这样就可在最后的一次划线重叠，这样就可在最后的1-21-2次划线上出现多量的单个菌落，以便进次划线上出现多量的单个菌落，以便进行纯培养。行纯培养。具体操作：具体操作：取病料，将体表的泥沙等杂物用清水冲洗干净取病料，将体表的泥沙等杂物用清水冲洗干净取病料，将体表的泥沙等杂物用清水冲洗干净取病料，将体表的泥沙等杂物用清水冲洗干净取干净托盘，将病料置于托盘中取干净托盘，将病料置于托盘中取干净托盘，将病料置于托盘中取干净托盘，将病料置于托盘中托盘置于工作台上，接种前准备好酒精灯、接种托盘置于工作台上，接种前准备好酒精灯、接种托盘置于工作台上，接种前准备好酒精灯、接种托盘置于工作台上，接种前准备好酒精灯、接种环、酒精棉球、解剖刀、剪刀、镊子等。事先作环、酒精棉球、解剖刀、剪刀、镊子等。事先作环、酒精棉球、解剖刀、剪刀、镊子等。事先作环、酒精棉球、解剖刀、剪刀、镊子等。事先作好准备工作，把所用的物品器械摆好好准备工作，把所用的物品器械摆好好准备工作，把所用的物品器械摆好好准备工作，把所用的物品器械摆好 解剖病料，将接种环烧红冷却后接触病变部位，解剖病料，将接种环烧红冷却后接触病变部位，解剖病料，将接种环烧红冷却后接触病变部位，解剖病料，将接种环烧红冷却后接触病变部位，平板划线。如体表创伤溃烂部位，病变内脏。腹平板划线。如体表创伤溃烂部位，病变内脏。腹平板划线。如体表创伤溃烂部位，病变内脏。腹平板划线。如体表创伤溃烂部位，病变内脏。腹水可直接涂布平板水可直接涂布平板水可直接涂布平板水可直接涂布平板平板置于平板置于平板置于平板置于28 28 恒温培养箱培养恒温培养箱培养恒温培养箱培养恒温培养箱培养24h24h，观察细菌生，观察细菌生，观察细菌生，观察细菌生长状况长状况长状况长状况（注意：操作台在使用前后都需要用酒精棉球擦拭注意：操作台在使用前后都需要用酒精棉球擦拭注意：操作台在使用前后都需要用酒精棉球擦拭注意：操作台在使用前后都需要用酒精棉球擦拭台面，保持操作台的整洁台面，保持操作台的整洁台面，保持操作台的整洁台面，保持操作台的整洁）二、细菌的培养二、细菌的培养n n培养基：培养基是指由人工方法配合而成的，用于微生物培养基：培养基是指由人工方法配合而成的，用于微生物培养、分离、鉴别、研究和保存菌种用的混合营养制品。培养、分离、鉴别、研究和保存菌种用的混合营养制品。n n培养基的种类培养基的种类 基础培养基：含有一般细菌生长繁殖需要的基本营养物基础培养基：含有一般细菌生长繁殖需要的基本营养物质；可作为一些特殊培养基的基础成分质；可作为一些特殊培养基的基础成分（普通营养琼脂普通营养琼脂普通营养琼脂普通营养琼脂） 加富培养基：在基础培养基中加入某些特殊营养物质加富培养基：在基础培养基中加入某些特殊营养物质（如血液（如血液/ /血清、酵母浸膏或生长因子等）；用以培养对血清、酵母浸膏或生长因子等）；用以培养对营养要求高的微生物（营养要求高的微生物（2216E2216E） 选择培养基：利用细菌对某种或某些化学物质的敏感性选择培养基：利用细菌对某种或某些化学物质的敏感性不同；在培养基中加入这类物质，利于所需分离的细菌生不同；在培养基中加入这类物质，利于所需分离的细菌生长，而抑制不需要的细菌生长，从而达到分离某种微生物长，而抑制不需要的细菌生长，从而达到分离某种微生物的目的。（的目的。（中国科学院海洋研究所专利：中国科学院海洋研究所专利：中国科学院海洋研究所专利：中国科学院海洋研究所专利：一种定量检测鳗弧一种定量检测鳗弧一种定量检测鳗弧一种定量检测鳗弧菌的选择性培养基及其制备菌的选择性培养基及其制备菌的选择性培养基及其制备菌的选择性培养基及其制备）【利用鳗弧菌对氨苄青霉素的抗性利用鳗弧菌对氨苄青霉素的抗性 】 鉴别培养基：是一类含有某种特定化合物或试剂的培养鉴别培养基：是一类含有某种特定化合物或试剂的培养基。某种细菌在这种培养基上培养后，产生某种代谢产物，基。某种细菌在这种培养基上培养后，产生某种代谢产物，能与这种特定化合物或试剂发生某种明显的特征性反应；能与这种特定化合物或试剂发生某种明显的特征性反应；从而达到区分不同的微生物。（从而达到区分不同的微生物。（TCBSTCBS） v病料在接种培养基后，经过一段时间，应检查其生长状况。首先用肉眼检查有无细菌生长；若有，则需进一步检查菌落是否纯一。形态特征包括：大小、形状、突起或扁平、凹陷、边缘（光滑、波形、锯齿状、卷发状等）、颜色（红色、灰白色、黄色等）、表面（光滑、粗糙等）、透明度（不透明、半透明、透明等）和粘度等 v多数情况下，沿划线生长较多的菌落，是待检病原菌的可能性较大；少数零散分布或不在划线上生长的菌落，多为杂菌。为慎重起见，可挑选若干个可疑菌落分别进行划线，进一步纯化培养 v如果需要扩大培养，可挑取单菌落接种至液体培养基，摇床培养三、细菌的鉴定三、细菌的鉴定一）传统方法：一）传统方法：常规宏观菌落形态学观察, 主要观察菌落在其适合的培养基上的生长状况。细菌的个体形态学观察, 即通过显微镜观察。形态学鉴定辅以生化试验在细菌鉴定中具有重要的意义（生化鉴定管、药敏实验等）二）仪器的自动化鉴定：二）仪器的自动化鉴定：VITEK 系统、M IDI系统、BIOLOG 系统、SENS ITITRE 系统、AUTOSCEPTOR系统以及MICROSCAN系统等（ATB Expression）三）分子生物学方法三）分子生物学方法: :基因测序、指纹图谱技术、基因探针技术、聚合酶链反应( PCR)、GC 含量测定等生化鉴定管生化鉴定管 各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基质的分解能力也不一样，因而代谢产物或多或少地各有区别，可供鉴别细菌之用 ATB Expression：自动化微生物鉴：自动化微生物鉴定和药敏分析系统定和药敏分析系统 分子生物学技术分子生物学技术n n分子生物学鉴定目前比较流行的主要是核酸检测技术, 包括基因测序、指纹图谱技术、基因探针技术、聚合酶链反应( PCR)、GC 含量测定等。n nPCR和核酸杂交单独或结合在仪器已经形成比较经典的核酸检测技术, 目前这两者已经得到了较大范围的推广和应用 w微生物学工作必须在一个清洁卫生的环微生物学工作必须在一个清洁卫生的环境中进行，实验室的整洁与否直接影响境中进行，实验室的整洁与否直接影响实验效果。在卫生状况差而零乱的实验实验效果。在卫生状况差而零乱的实验室中不可能取得好的实验效果；实验室室中不可能取得好的实验效果；实验室脏、乱，不但增加了污染的机会，同时脏、乱，不但增加了污染的机会，同时也影响人的安全和情绪，所以，清洁、也影响人的安全和情绪，所以，清洁、明亮的实验环境是顺利开展工作的保障明亮的实验环境是顺利开展工作的保障之一；保持实验室清洁是学生进入实验之一；保持实验室清洁是学生进入实验应尽的责任。应尽的责任。w请大家自觉维持实验室的卫生和秩序！请大家自觉维持实验室的卫生和秩序！