实验九实验九 氨基酸含量的测定氨基酸含量的测定（茚三酮比色法）（茚三酮比色法）1. 实验原理实验原理 凡凡含含有有自自由由氨氨基基的的化化合合物物，如如蛋蛋白白质质、多多肽肽、氨氨基基酸酸（脯脯氨氨酸酸除除外外）在在碱碱性性溶溶液液中中与与水水合合茚茚三三酮酮共共热热时时，产产生生紫紫色色化化合合物物，最最大大吸吸收收波波长长在在570nm处处，在在一一定定浓浓度度范范围围内内，颜颜色色深深浅浅与与氨氨基基酸含量成正比，可用比色法进行测定。酸含量成正比，可用比色法进行测定。 氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤：氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤：2. 实验材料、仪器与试剂实验材料、仪器与试剂材料：材料：酱油酱油仪器：仪器：可见分光光度计，分析天平，容量瓶，可见分光光度计，分析天平，容量瓶，移液管，具塞刻度试管。移液管，具塞刻度试管。试剂：试剂：茚三酮、氯化亚锡、磷酸二氢钾、磷茚三酮、氯化亚锡、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、标准氨基酸（异亮氨酸）。酸氢二钠、标准氨基酸（异亮氨酸）。3. 实验步骤实验步骤（1）样品的处理：）样品的处理：准确吸取准确吸取0.5mL酱油于酱油于100mL烧杯中，加入烧杯中，加入5g活性炭和活性炭和50mL蒸馏水，置于蒸馏水，置于80水浴锅中，保持半小时后过滤，用蒸馏水将滤渣清水浴锅中，保持半小时后过滤，用蒸馏水将滤渣清洗数遍，收集滤液于洗数遍，收集滤液于100mL容量瓶中，定容至刻线，容量瓶中，定容至刻线，摇匀备用。摇匀备用。各种试剂加到比色管后混匀，于电炉上沸水浴各种试剂加到比色管后混匀，于电炉上沸水浴15min，取出冷却至室，取出冷却至室温后加水至温后加水至10mL刻度线，静置刻度线，静置15min后，在后，在570nm处测定吸光度，处测定吸光度，以氨基酸含量以氨基酸含量(g)为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。（2）标准曲线的绘制）标准曲线的绘制管号管号1234567氨基酸标准溶液氨基酸标准溶液/mL00.50.60.70.80.91.0水水/mL1.61.11.00.90.80.70.6磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液/mL0.40.40.40.40.40.40.4茚三酮茚三酮/mL0.40.40.40.40.40.40.4氨基酸含量氨基酸含量/g0100120140160180200 按上表加样后混匀，按标准曲线的步骤进行按上表加样后混匀，按标准曲线的步骤进行实验，在相同条件下测定样品的吸光度，并在标实验，在相同条件下测定样品的吸光度，并在标准曲线上查出氨基酸含量微克数。准曲线上查出氨基酸含量微克数。（3）样品测定）样品测定管号管号891011样品溶液样品溶液/mL00.50.50.5水水/mL1.61.11.11.1磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液/mL0.40.40.40.4茚三酮茚三酮/mL0.40.40.40.44. 结果计算结果计算5. 说明及注意事项说明及注意事项（1）该法是微量法，对氨基酸的最低检出量可）该法是微量法，对氨基酸的最低检出量可达，其其灵敏度高，重现性好。达，其其灵敏度高，重现性好。（2）脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，）脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，最大吸收波长在最大吸收波长在440nm处。处。（3）通常采用的样品处理方法为：准确称取粉碎）通常采用的样品处理方法为：准确称取粉碎后的样品后的样品5g10g或吸取液体样品或吸取液体样品5mL10mL，置于烧杯中，加入置于烧杯中，加入50mL蒸馏水和蒸馏水和5g左右的活性炭，左右的活性炭，加热煮沸，过滤。用加热煮沸，过滤。用30mL40mL热水洗涤活性热水洗涤活性炭，收集滤液于炭，收集滤液于100mL容量瓶中，加水至刻度线，容量瓶中，加水至刻度线，摇匀备用。摇匀备用。6. 思考题思考题（1）茚三酮法测定氨基酸的原理是什么？）茚三酮法测定氨基酸的原理是什么？（2）试比较三种方法测定氨基酸含量的优缺点）试比较三种方法测定氨基酸含量的优缺点各是什么？各是什么？