实验七实验七 过氧化氢酶米氏常过氧化氢酶米氏常数（数（K Km m）的测定）的测定1一、实验目的一、实验目的n学习米氏常数（学习米氏常数（Km）的测定方法。）的测定方法。 2 二、实验原理二、实验原理n过氧化氢酶过氧化氢酶(CAT)催化下列反应：催化下列反应：n2H2O22H2O+O2 H2O2浓度可用浓度可用KMnO4在硫酸存在下滴在硫酸存在下滴定测知。定测知。n2KMnO45H2O23H2SO4 2MnSO4K2SO45O28H2On 求出反应前后求出反应前后H2O2的浓度差即为反应速的浓度差即为反应速度。双倒数作图法求出过氧化氢酶的米度。双倒数作图法求出过氧化氢酶的米氏常数。氏常数。3米氏常数的测定：双倒数作图法（米氏常数的测定：双倒数作图法（Lineweaver-Lineweaver-BurkBurk法）法） 1 KmKm 1 1 = . + v Vmax S Vmax 4三、试剂n 10.05mol/L草酸钠标准液草酸钠标准液 将草酸钠将草酸钠（AR）于）于100105烘烘12h。冷却后，准确。冷却后，准确称取称取0.67g，用水溶解倒入，用水溶解倒入100ml量瓶中，加量瓶中，加入浓入浓H2SO4 5ml，加蒸馏水至刻度，充分混，加蒸馏水至刻度，充分混匀，此液可贮存数周。匀，此液可贮存数周。n 2约约0.02ml KMnO4储存液储存液 称取称取KMnO4 3.4g，溶于，溶于1000ml蒸馏水中，加热蒸馏水中，加热搅拌，待全部溶解后，用表面皿盖住，在低于搅拌，待全部溶解后，用表面皿盖住，在低于沸点温度上加热数小时，冷后放置过夜，玻璃沸点温度上加热数小时，冷后放置过夜，玻璃丝过滤，棕色瓶内保存。丝过滤，棕色瓶内保存。 5n30.004mol/L KMnO4应用液应用液 取取0.05mol/L草酸钠标准液草酸钠标准液20ml，于锥形瓶中，于锥形瓶中，加浓加浓H2SO4 ml，于，于70水浴中用水浴中用KMnO4贮贮存液滴定至微红色，根据滴定结果算出存液滴定至微红色，根据滴定结果算出KMnO4贮存液的标准浓度，稀释成贮存液的标准浓度，稀释成0.004mol/L，每次稀释都必须重新标定储存，每次稀释都必须重新标定储存液。液。n4约约0.05mol/L H2O2液液 取取20%H2O2（AR）40ml于于1000.0ml量瓶中，量瓶中，加蒸馏水至刻度，临用时用加蒸馏水至刻度，临用时用0.004mol/L KMnO4标定之，稀释至所需浓度。标定之，稀释至所需浓度。n50.2mol/L磷酸盐缓冲液（磷酸盐缓冲液（pH7.0）。）。6四、操作步骤四、操作步骤n l血液稀释血液稀释 吸取新鲜（或肝素抗凝）血液吸取新鲜（或肝素抗凝）血液0.1ml，用磷酸盐缓冲液，用磷酸盐缓冲液(pH7.0，0.2mol/L)稀稀释至释至150ml，得，得1：1500稀释血液。稀释血液。n 2H2O2浓度的标定：取洁净锥形瓶两只，浓度的标定：取洁净锥形瓶两只，各加浓度约为各加浓度约为0.05mol/L的的H2O2 2.0ml和和25%H2SO4 2.0ml，分别用，分别用0.004mol/L KMnO4滴定至微红色。从滴定用去滴定至微红色。从滴定用去KMnO4ml数，求数，求出出H2O2的的mol浓度。浓度。73反应速度的测定：取干燥洁净反应速度的测定：取干燥洁净50ml锥形瓶锥形瓶5只，编号，按下表只，编号，按下表操作。操作。8加入物加入物(ml) 12345H2O2(约约0.05mol/L) 0.51.52.53.54.5蒸馏水蒸馏水 4.03.02.01.0血液稀释液血液稀释液0.50.50.50.50.537度保温度保温5分钟分钟25硫酸硫酸2.02.02.02.02.00.004高锰酸钾高锰酸钾9n依次加入依次加入1：1500稀释血液每瓶稀释血液每瓶0.5ml，边加边摇，反应时间，边加边摇，反应时间5min，按顺序按顺序向向各瓶加各瓶加25%H2SO4 2.0ml，边加边摇，边加边摇，使酶促反应立即终止。使酶促反应立即终止。n最后用最后用0.004mol/L KMnO4滴定各瓶至滴定各瓶至微红色，记录微红色，记录KMnO4消耗量消耗量(ml)。10五、计算五、计算 n1.反应速度的计算：反应速度的计算：以反应消耗的以反应消耗的H2O2 mmol数表示。数表示。n反应速度反应速度=加入的加入的H2O2 mmol数剩余数剩余的的H2O2 mmol数数n即：即：H2O2 mol浓度浓度加入的毫升数加入的毫升数KMnO4 0.004 mol/L消耗的消耗的KMnO4毫升数毫升数 5/2n（式中：（式中：5/2为为KMnO4与与H2O2反应中反应中mol换算系数）换算系数）11n2求求Km值：值：n下面引用一次实验结果为例，求过氧化下面引用一次实验结果为例，求过氧化氢酶的氢酶的Km值，供计算参考。值，供计算参考。n己知己知KMnO4为为0.004mo1/L，标定出，标定出H2O2浓度为浓度为0.05mol/L，列表计算如下：，列表计算如下：12计计算程序算程序12345加人加人H2O2数数0.501.001.502.002.50加人加人H2O2mmol=0.080.040.080.120.160.20底物底物浓浓度度S=50.010.020.030.040.05酶酶作用后，作用后，KMnO4滴定滴定ml1.353.706.409.8013.20剩余剩余H2O2mmol=0.0045/20.01350.0370.0640.0980.132反反应应速度速度V=一一0.02650.0430.0560.0620.068按前述方法作图求得按前述方法作图求得Km2.510-2mol/L。13六、思考题nlKm值的意义是什么？值的意义是什么？n2测酶测酶Km值的实验中，需要特别注意值的实验中，需要特别注意哪些操作？哪些操作？14