原位杂交操作流程原位杂交操作流程2021/8/261冰冻切片的（冰冻切片的（DIG-labeledRNAprobe）原位杂交操作程序）原位杂交操作程序一、一、切片制备切片制备用新鲜组织制作用新鲜组织制作6m厚冰冻切片，厚冰冻切片，37干燥干燥14小时，进行下一步操作。小时，进行下一步操作。二、二、预杂交前处理预杂交前处理预固定预固定：4%PFA（inDEPC-PBSPh7.4）RT3060min4%PFA：多聚甲醛多聚甲醛20g1PBS450ml加热（加热（60、20min）溶解）溶解冷却后调冷却后调pH至至7.41PBS500mlPBSRT5min210PBS：500mlNaCl40gKCl1gKH2PO41gNa2HPO47.7gDEPC水水450ml调调Ph至至7.5DEPC水加至水加至500mlPBS(含含0.3%v/vTritonX-100)RT15min临用前配制临用前配制10%TritonX-10015ml1PBS500mlPBSRT5min22021/8/262消化消化：2g/mlProteinaseKinTEbuffer3710minTE：pH8.0Tris-HCl1M5mlpH8.0EDTA0.5M1mlDEPC水水500ml0.2%GlycininPBSRT5min2(50xDenharts;Ficoll400聚蔗糖聚蔗糖1g后固定后固定：4%PFAinPBSRT15minPVP聚乙烯基吡咯烷酮聚乙烯基吡咯烷酮1gBSA牛血清白蛋白牛血清白蛋白1g DEPC水水100ml）PBSRT3min20.1M三乙醇胺（三乙醇胺（TEA）/0.25%乙酸酐乙酸酐RT5min20.1M三乙醇胺三乙醇胺：三乙醇胺：三乙醇胺2.64mlDEPC水水200ml用前加入乙酸酐用前加入乙酸酐500lPBSRT5min22021/8/263三、三、预杂交预杂交 预杂交预杂交502h预杂交液：预杂交液：50%去离子甲酰胺去离子甲酰胺5SSC5Denhardts0.02%SDS0.1mg/mltRNA四、四、杂交杂交杂交杂交5012h以上以上2021/8/264五、五、杂交后处理杂交后处理2SSC脱去盖膜（片）脱去盖膜（片）502SSC清洗清洗3710min220g/mlRNaseAinRnsaebuffer3730minRnsaebuffer;2MTris5ml0.25MEDTA4ml3MnaCl167mlpH8.0DW1000mlRnasebuffer3730min2SSC5015min21SSC（含（含0.02%SDS）3715min25%SDS2ml1SSC500ml0.1SSC3715min22021/8/265Buffer3710min2Buffer:2MTris-HClPh7.625ml3MNaCl25mlD.W.500ml封闭；封闭；0.5%抗体阻断液抗体阻断液inBuffer（含（含0.2%Tween20）3720min抗体阻断液抗体阻断液:(1:500抗地高辛抗体抗地高辛抗体in阻断液阻断液372h)阻断剂阻断剂1gTween-200.4mlBuffer3710min2Buffer200mlBuffer3710min22021/8/266显色；显色； Buffer:2MTris10ml（1:50NBT/BCIPStockSolutioninBuffer224h）3MNaCl6.67mlMgCl22.033g（湿合、避光）（湿合、避光）D.W.180ml 浓浓HCl调调pH至至9.5D.W.200ml终止反应：终止反应： BufferRT5min2流水冲洗流水冲洗5-10min1%甲基绿复染甲基绿复染3-10min，水洗，晾干，封固水洗，晾干，封固2021/8/267DNA探针检测石蜡切片中DNA2021/8/268组织标本肝穿刺组织，常规石蜡包埋，4m连续石蜡切片，贴在涂有切片粘合剂的干净载玻片上，58烤18h。2021/8/269试剂试剂1 120SSC20SSC2 2HBV cDNA-DigHBV cDNA-Dig探针探针 5 5 g g3 34 4多聚甲醛多聚甲醛4 40.1mol/L PBS0.1mol/L PBS，pH7.4pH7.45 50.2mmol/L HCl 0.2mmol/L HCl 和和0.1mol/L0.1mol/L甘氨酸甘氨酸 PBS pH7.4 PBS pH7.46 60.4 0.4 Tritor X-100 PBS pH7.4Tritor X-100 PBS pH7.47 7蛋白酶蛋白酶 20 20 g/mlg/ml8 80.250.25乙酸酐，用乙酸酐，用0.1mol/L0.1mol/L三乙醇胺配制三乙醇胺配制9 9预杂交缓冲液和杂交缓冲液预杂交缓冲液和杂交缓冲液10. AKP10. AKP标记抗标记抗Dig FabDig Fab段二抗，可段二抗，可1:5001:500稀释稀释11. TSM11. TSM、TSM2TSM2（配制参阅附录（配制参阅附录4 4）12. NBT12. NBT和和BCIPBCIP显色液或用显色液或用AKPAKP显色显色KitKit 2021/8/2610操作流程杂交前处理预杂交杂交杂交后漂洗杂交后检测结果判断2021/8/2611杂交前处理1. 石蜡切片常规脱蜡至水2. 0.02M pH7.4 PBS洗33min3. 0.2M HCI 20min 室温 （除去蛋白）4. 2SSC（内含5M EDTA） 50 洗 30min5. 蛋白酶 2g/ml 37 20min6. 0.1M甘氨酸PBS洗 10min 室温，中止酶反应7. 4多聚甲醛，20min 室温8. PBS洗 33min9. 75，85，95和无水乙醇各2min2021/8/2612预杂交和杂交加预杂交液 20l/每片，42 2h。 加杂交液1020ul/每片（内含HBV-cDNA Dig标记探针4g/ml），加盖硅化玻片，将切片置于95 10min，使探针和靶病毒DNA双链打开（变性），然后迅速置于冰上5min，再将切片置于盛有2SSC湿合内，42杂交过夜(1216h)。2021/8/2613杂交后漂洗杂交后漂洗1. 将切片置于2SSC液内振动移去盖片2. 2SSC洗 210min， 553. 0.5SSC 25min， 504. PBS洗33min5. 10醋酸 20min 室温，阻断内源性碱性磷酸酶6. PBS洗33min2021/8/2614信号放大和显示信号放大和显示1. 1:500稀释AKP标记抗Dig二抗，37 4h，或4过夜2. PBS洗 33min3. TSM1洗 25min4. TSM2洗 25min5.显色液 在1mlTSM2中加入4.5lNBT，3.5l， BCIP 混合后，显色30min12h，中间不断观察6. TSM2洗，PBS洗33min，核固红或甲基绿衬染7. 蒸镏水洗，系列乙醇脱水，二甲苯透明，树脂封片2021/8/2615结果判断结果判断2021/8/2616ISHISH流程流程探针合成探针合成组织细胞标本的准备组织细胞标本的准备ISHISH试剂的配制试剂的配制操作流程操作流程2021/8/2617探探针针 1、根据文献报道合成PCR引物一对。 2、PCR扩增：用高保真DNA聚合酶 进行PCR扩增。2021/8/2618 3、将PCR扩增产物亚克隆入pGEM2Z质粒（EcoRI和ACC I酶切位点），在大肠杆菌中扩增，纯化。原理：PGEM3质粒购于promega公司，含有位于pUc19 MCS侧面的SP6和T7 RNA聚合酶启动子，在将所需序列插入MCS后，一个简单的基于lac Z -肽灭活的颜色选择方案将促进重组体的筛选。在体外，将SP6或T7 RNA聚合酶加入到含有标记物的三磷酸核苷前体的转录系统中，可允许从任何一方向产生多拷贝DNA插入序列的标记RNA探针。2021/8/26194、利用Roche生产的体外转录标记RNA kit（Cat.No 999644）操作流程参阅原位检测技术p132-133。2021/8/2620组织细胞标本的准备组织细胞标本的准备 ISHISH试试剂剂的的配配制制（所所有有试试剂剂和和用用具具均用均用DEPCDEPC水处理）水处理）2021/8/2621操作流程操作流程11、活细胞经4多聚甲醛固定20min，室温，PBS洗，系列乙醇脱水。2、组织标本：标准取材后，4多聚甲醛固定6h，用25遮糖或液氮速冻，切片贴在涂有APES胶的干净载玻片上。3、PBS洗33min，冰冻切用4%柠檬酸盐90保温20min，石蜡切片98 10min，细胞片不用。4、2g/ml蛋白酶K 37 20min，PBS洗33min。5、0.1mol/L甘氨酸PBS洗10min.6、0.25%乙酸酐的0.1mol/L三乙醇胺(pH8.0)洗10min，PBS洗10min。2021/8/26227 7、预杂交、预杂交 0.2SSC 0.2SSC5050甲酰胺甲酰胺 30min 37 30min 37。8 8、杂交：滴加杂交液（、杂交：滴加杂交液（2g/ml2g/ml） 加一层复盖膜，加一层复盖膜，4848杂交杂交8-12h8-12h。9 9、杂交后洗：、杂交后洗： 2SSC 2SSC洗洗 25min 45 25min 45 1SSC 1SSC洗洗 25min 25min 室温室温 0.5SSC 0.5SSC洗洗 25min 25min 室温室温 0.1SSC 0.1SSC洗洗 25min 25min 室温室温 PBS PBS洗洗 33min 33min2021/8/262310、用10正常血清封闭 30min11、抗Dig IgG 1:500 37 1h12、PBS洗 33min13、0.02M TBS pH9.015min14、NBT/BCIP显色 1h-24h15、洗后，核固红衬染，蒸馏水洗，脱 水，透明，封片。16、结果观察：紫蓝色为阳性信号，红 色为背景。2021/8/2624 刚才的发言，如刚才的发言，如有不当之处请多指有不当之处请多指正。谢谢大家！正。谢谢大家！2021/8/2625部分资料从网络收集整理而来，供大家参考，感谢您的关注！