血清总蛋白和白血清总蛋白和白/球比值测定球比值测定一、血清总蛋白的测定（双缩脲法）一、血清总蛋白的测定（双缩脲法）二、血清白蛋白的测定（溴甲酚绿法）二、血清白蛋白的测定（溴甲酚绿法）血清总蛋白和白球比值测定实验目的：实验目的：1、熟悉血清总蛋白的测定方法：双缩脲法2、掌握血清总蛋白测定的临床意义3、熟悉血清白蛋白的测定方法：溴甲酚绿法4、掌握血清白蛋白测定和白蛋白与球蛋白的含量比（A/G）测定的临床意义血清总蛋白和白球比值测定一、血清总蛋白的测定一、血清总蛋白的测定实验原理：实验原理：1、双缩脲反应双缩脲反应：两个尿素分子缩合生成双缩脲（H2NOCNHCONH2)，在碱性溶液中与铜离子作用，生成稳定的紫红色配合物，即双缩脲反应。CuSO4的碱性溶液称双缩脲试剂。双缩脲双缩脲+铜离子铜离子 紫红色紫红色2、蛋白质的定量测定蛋白质的定量测定：蛋白质与双缩脲相似，分子中的肽键能与双缩脲试剂形成紫色配合物。这种紫色配合物在540nm处有明显吸收峰。吸光度在一定范围内与蛋白质含量成正比，常用于蛋白质的定量测定。碱性溶液碱性溶液血清总蛋白和白球比值测定生理盐水生理盐水双缩脲试剂双缩脲试剂蛋白质标准液蛋白质标准液待测血清稀释液待测血清稀释液实验试剂： 生理盐水生理盐水：氯化钠0.9g溶于10ml蒸馏水。 双缩脲试剂双缩脲试剂：硫酸铜3.0g溶于500ml蒸馏水， 加酒石酸钾钠9.0g，完全溶解后，加入24%氢氧化钠100ml，用蒸馏水稀释到1L，置于聚氯 乙烯瓶内盖紧保存。 蛋白质标准溶液蛋白质标准溶液：收集混合血清，经凯氏定 氮法定值，用作蛋白质标准液。储存于冰箱中备用。也可用10mg/mL牛血清白蛋白替代。 待测血清用生理盐水按1:10稀释。血清总蛋白和白球比值测定实验步骤：实验步骤： 混匀，混匀，3737度水浴放置度水浴放置10min10min，以空白管调零点，以空白管调零点，在在540nm540nm波长处进行比色，分别读取各管的吸光度。波长处进行比色，分别读取各管的吸光度。计算计算: :血清总蛋白含量血清总蛋白含量= = * *蛋白质标准液浓度蛋白质标准液浓度* *稀释倍数稀释倍数（g/Lg/L） 测定管 标准管 空白管血清/mL 1.00 蛋白质标准液/mL 1.00 生理盐水/mL 1.00双缩脲试剂/mL 5.0 5.0 5.0取3支试管，按下表操作。A测定测定A标准标准血清总蛋白和白球比值测定临床意义：临床意义：1 1、血清总蛋白浓度增高、血清总蛋白浓度增高（1）血液浓缩，导致总蛋白浓度相对增高：严重腹泻、呕吐、高烧时急剧失水、休克、慢性肾上腺皮质功减退，血清总蛋白浓度可明显升高。（2）血浆蛋白质合成增加：主要见于球蛋白合成增加，如多发性骨髓瘤患者，其蛋白含量可超过50g/L。血清总蛋白和白球比值测定2 2、血清总蛋白浓度降低、血清总蛋白浓度降低（1）血液稀释，导致总蛋白浓度相对降低：如静脉注射过多低渗溶液或因各种原因引起的钠、水潴留。（2）摄入不足和消耗增加：食物中长期缺乏蛋白质，慢性胃肠道疾病引起的消化吸收不良，患消耗性疾病等，均可造成血清蛋白浓度降低。（3）合成障碍：主要见于肝脏患疾。血浆清蛋白及大部分球蛋白均由肝脏合成，肝功能严重损害时，血浆蛋白质的合成量减少，其中以清蛋白浓度降低最为明显。（4）蛋白质丢失：严重烧伤时大量血浆渗出，大量失血。血清总蛋白和白球比值测定1、双缩脲试剂中酒石酸钾钠的作用是配合铜离子，以维持铜离子在碱性溶液中的溶解性；碘化钾是抗氧化剂，防止碱性酒石酸自动还原。2、由于各种血清蛋白质的相对分子质量不同，古其浓度不宜用mol/L表示，而用g/L表示。3、高脂、黄疸及溶血标本应做血清空白对照来校正误差。4、本法绘制的标准曲线是一条通过原点的直线，在浓度小于100g/L时呈良好的线性关系。注意事项：注意事项：血清总蛋白和白球比值测定二、血清白蛋白的测定二、血清白蛋白的测定实验原理：实验原理：1、溴甲酚绿法溴甲酚绿法：在不分离血清中白蛋白的情况下直接测定白蛋白的一种方法。白蛋白具有与阴离子染料结合的性质，在pH=4.2的环境中，带正电荷的白蛋白（pI=4.9）与阴离子染料溴甲酚绿结合，由黄色变为蓝绿色。白蛋白白蛋白+溴甲酚绿溴甲酚绿 蓝绿色复合物蓝绿色复合物 2、白蛋白含量的测定白蛋白含量的测定：蓝绿色的深浅与白蛋白的浓度成正比，因此可直接测定血清白蛋白的含量。pH=4.2血清总蛋白和白球比值测定 溴甲酚绿储存液溴甲酚绿储存液：BCG 419mg溶于10ml 0.1mol/L NaOH，加NaN3 100mg，定容至1L，储存于棕色瓶中备用。 0.1mol/L柠檬酸缓冲液（柠檬酸缓冲液（pH=4.2）：分别配制 0.1mol/L柠檬酸和柠檬酸钠溶液，按体积比 12.3 : 7.7 混合。每1L混合液加入NaN3 100mg。 30%聚氧化乙烯月桂醚溶液聚氧化乙烯月桂醚溶液：取Brij-35 30g，加少量水，60度水浴溶解加水至100ml。 BCG应用液应用液：BCG储存液 250ml、0.1mol/L柠檬酸缓冲液(pH=4.2) 750ml、30% Brij-35混合而成。 标准蛋白溶液标准蛋白溶液(10mg/ml)：称取人白蛋白 1.00g，用生理盐水溶解并定容至100ml。实验试剂：实验试剂：血清总蛋白和白球比值测定实验步骤：实验步骤：1 1、白蛋白标准曲线的绘制、白蛋白标准曲线的绘制 取4支试管，按下表稀释标准液。编号1234白蛋白标准液/ml0.100.200.400.60生理盐水/ml0.900.800.600.40稀释后白蛋白含量/(mg/ml)1.002.004.006.00编号01234生理盐水/ml0.20 上述14管标准稀释液/ml0.200.200.200.20BCG应用液/ml5.005.005.005.005.00各管混匀后，另取5支试管，按下表操作。血清总蛋白和白球比值测定 混匀后以空白管校零，立即比色，比色波长为620nm,以吸光度为纵坐标，相应管中的白蛋白浓度为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。2 2、血清白蛋白的测定、血清白蛋白的测定 用生理盐水按 1:10 的比例稀释血清，取稀释后的血清0.2ml，加入BCG应用液 5.0ml，混匀后立即同上比色，读取吸光度，并从标准曲线上查出相应的白蛋白浓度。3 3、白蛋白与球蛋白的含量比、白蛋白与球蛋白的含量比(A/G)(A/G) 用双缩脲法测定血清标本中的总蛋白浓度，用总蛋白浓度减去白蛋白浓度即得球蛋白浓度，并可求得白蛋白与球蛋白的含量比： 白蛋白与球蛋白含量比白蛋白与球蛋白含量比= = 白蛋白含量白蛋白含量总蛋白含量总蛋白含量白蛋白含量白蛋白含量血清总蛋白和白球比值测定临床意义：临床意义：（1）血清白蛋白浓度增高：常见于严重脱水所导致的血浆浓缩。（2）血清白蛋白浓度降低：在临床上比较重要和常见，通常与总蛋白降低的原因大致相同。急性降低主要见于大出血和严重烧伤；慢性降低见于肾病蛋白尿、肝功能受损、肠道肿瘤及结核病伴慢性出血、营养不良和恶性肿瘤等。当血清白蛋白低于20g/L时，临床上出现水肿。（3）白蛋白与球蛋白的含量比：正常范围为1.52.5。某些病人可同时出现白蛋白减少和球蛋白升高的现象，严重者白蛋白与球蛋白的含量比小于1.0，这种情况称为A/G倒置。血清总蛋白和白球比值测定（1）BCG除与白蛋白结合外，还可与球蛋白及球蛋白结合，但与后者结合速度较慢，其显色强度分别为白蛋白的20%及10%，因此本方法操作中应控制比色时间，在BCG加入后30s内完成测定，避免球蛋白参与反应。（2）BCG本身是一种pH指示剂，变色域为pH=3.8（显黄色）5.4（显蓝绿色），因此控制反应液的pH值是本法测定的关键。注意事项：注意事项：血清总蛋白和白球比值测定谢谢观赏！血清总蛋白和白球比值测定血清总蛋白和白球比值测定