真核细胞RNA的提取及电泳分析 中南大学生命科学学院实验目的实验目的q掌握一种真核细胞RNA的提取方法 q熟悉RNA的琼脂糖凝胶电泳检测分析 实验原理实验原理qrRNA,8085%qtRNA,1015%，约5S/70-120nt qmRNA,15% ，长短不一28S，4700 nt18S，1900 nt5.8S，160 nt5S，120 nt哺乳动物细胞总RNA:真核细胞RNA分布于胞质75%、胞核10%、细胞器15% 实验原理实验原理qTrizol试剂是由苯酚和异硫氰酸胍等组成的单相、快速抽提总RNA的试剂。q十二烷基肌氨酸钠：破细胞膜及核膜，释放RNA、DNA和蛋白。q异硫氰酸胍：RNase 抑制剂，抑制内源性RNase。q苯酚：使蛋白变性。实验原理实验原理q当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，离心后形 成水相层和有机相层。RNA位于水相，而DNA和蛋白质位于分界层和有机相。q水相中RNA在高盐和有机溶剂共存时沉淀分离。 q提取的RNA可用于Northern杂交、mRNA分离、cDNA合成、RT-PCR。实验试剂实验试剂qRNAiso Bloodq氯仿q异丙醇q75%乙醇（DEPC处理水配制）qRNase-free水微量移液器台式微量离心机 电泳槽凝胶成像系统主要仪器主要仪器 电泳仪 实验步实验步骤骤1.取0.25 ml血液样品移至离心管中，添加 0.75 ml RNAiso Blood。2.用移液枪上下反复吸打直至细胞完全裂解。3.加入 0.2 ml氯仿，混匀至溶液呈乳白色。4. 室温静置 5 分钟。5. 12,000g、4离心 15 分钟。6. 吸取上清液移至新的离心管中（切勿吸出白色中间层）。7. 向上清中加入等量体积的异丙醇，上下颠倒混匀后，室温下静置 10 分钟。8.12,000g、4离心 10 分钟，试管底部会出现 RNA 沉淀。9.弃上清,加入等量的 75乙醇，振荡清洗沉淀后，7,500g、4离心 5 分钟，弃上清。10.室温干燥沉淀23分钟，加入30 l RNase-free 水溶解沉淀。11.取5 l电泳检测，剩余-70保存。注意事项注意事项RNase（核糖核酸内切酶）生物特性十分稳定，耐热、耐酸、耐碱，作用不需辅助因子，存在十分广泛，本实验的关键是创造一个无RNase的环境，减少RNA的降解。 注意事项注意事项q去除外源性RNase的污染，包括操作者、工作环境、试剂及耗材等环节 戴口罩和手套，少少说话； 工作台面洁净，可用3%H2O2擦洗，空气中无灰尘； 离心管、Tip等塑料品用0.1%DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液浸泡12h，后高温高压灭菌处理； 玻璃或陶瓷制品可180250干烤84h; RNA溶解水溶液用DEPC处理过，后高温高压灭菌使用（DEPC分解成CO2和H2O）q抑制内源性RNase的活性 细胞裂解后RNase随之释放，应及时加入其抑制剂，如异硫氰酸胍。注意事项注意事项qRNase活性抑制：物理法（高温），化学法（DEPC、VRC【氧钒核糖核苷复合物】、H2O2），生物法（RNasin）。q不同组织样品的预处理（如组织块、贴壁细胞）每10 510 7细胞可提取50100ugRNA。样品体积不要超过裂解液的10%。q样品保存：样品用Trizol打散后于-70可保存一个月以上。分离的RNA最好尽快反转录成cDNA等，保存在75%乙醇中于28一周，-20一年。结果分析结果分析电泳后应该是有3条主带，尤其是28S和18S两条带锐利清晰且亮度比约2:1，无DNA杂带及向前拖尾现象（无降解）。纯品RNA和DNA的OD260/OD280（R）应为2. 0和1.8，所以提取RNA的R值应保证在1.82.0，R2.2表示有降解。Tris水溶解RNA应保证2.0R2.2。-70和-20保存无明显差异，否则为内源性RNase污染。问题及解决方法问题及解决方法 抽提产量较低 1.样品裂解不完全减少样品、延长裂解时间或加大提取液；2.RNA未 完 全溶解，会带来OD比值过低延长溶解时间 且 RNA不可过分干燥；3.实验材料质量不佳新鲜样品或生长旺盛细胞；4.离心不够充分加大转速及延长时间。问题及解决方法问题及解决方法 RNA有降解1.样品不新鲜或提取过程时间有延误组织样边研磨边加入液氮；2.RNA 存放不够 低 温 -70；3.提取液加入不足 ， 内 源RNase没被充分抑制减少样品或加大提取液；4.外源RNase没被充分抑制所用试剂与耗材 要 有 防 止RNase处理。问题及解决方法问题及解决方法 有DNA污染1.样品裂解不完全，会带入蛋白污染；2.取上清时取道中间层，会带入蛋白污染；3.加入氯仿震荡过于剧烈。谢 谢！