第五节第五节 细菌的基因转细菌的基因转移和重组移和重组凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式，称为重新组合，形成新遗传型个体的方式，称为基因重组基因重组（gene recombination）或或遗传重组遗传重组（genetic recombination），），简称简称重组重组。作用：作用： 重重组可使生物体在未可使生物体在未发生突生突变的情况下，也能的情况下，也能产生新生新遗传型的个体。型的个体。重重组与与杂交的关系：交的关系：重重组是分子水平上的一个概念，可以理解成是是分子水平上的一个概念，可以理解成是遗传物物质分子水平分子水平上的上的杂交交而一般所而一般所说的的杂交交（hybridization）则是是细胞水平胞水平上的一个概念。上的一个概念。杂交中必然包含着重交中必然包含着重组，而重而重组则不限于不限于杂交交这一形式。一形式。真核微生物中的有性真核微生物中的有性杂交、准性交、准性杂交（交（parasexual hybridization）等及原核生物中的）等及原核生物中的转化、化、转导、接合和原、接合和原生生质体融合等都是基因重体融合等都是基因重组在在细胞水平上的反映。胞水平上的反映。微生物中各种形式基因重组的比较重组范围重组范围供体和受体的关系供体和受体的关系整套染色体整套染色体局部杂合局部杂合高频率高频率低频率低频率部分染色体部分染色体个别或少数基因个别或少数基因细胞融合或细胞融合或联结联结性细胞性细胞真菌的有真菌的有性生殖性生殖体细胞体细胞真菌的准真菌的准性生殖性生殖细胞间暂时沟通细胞间暂时沟通细菌的接合细菌的接合性导性导细胞间细胞间不接触不接触吸收游离吸收游离DNA片段片段转化转化噬菌体携带噬菌体携带DNA转导转导由噬菌体提由噬菌体提供遗传物质供遗传物质完整完整噬菌体噬菌体溶源转变溶源转变噬菌体噬菌体DNA转染转染基因重组的意义n基因重基因重组是是杂交育种的理交育种的理论基基础。n杂交育种的交育种的优点：点：n由于由于杂交育种交育种选用了已知性状的供体菌和受体菌作用了已知性状的供体菌和受体菌作为亲本，本，因此，不因此，不论在方向性在方向性还是自是自觉性方面，均比性方面，均比诱变育种前育种前进了了一大步。一大步。n利用利用杂交育种往往交育种往往还可以消除某一菌株在可以消除某一菌株在经过长期期诱变处理后所出理后所出现的的产量上升量上升缓慢的慢的现象，因此，它是一种重要的象，因此，它是一种重要的育种手段。育种手段。基因重组的意义n杂交育种的缺点：交育种的缺点：n由于由于杂交育种的方法交育种的方法较复复杂，工作，工作进展展较慢，慢，还很很难像像诱变育种技育种技术那那样得到普遍的推广和使用，尤其在原核生物的得到普遍的推广和使用，尤其在原核生物的领域中，域中，应用用转化、化、转导或接合等重或接合等重组技技术来培育可来培育可应用于生用于生产实践上的高践上的高产菌株的例子菌株的例子还不多不多见。到了。到了70年代后期，由年代后期，由于原生于原生质体融合技体融合技术获得巨大的成功后，才使重得巨大的成功后，才使重组育种技育种技术获得了得了飞速的速的发展。展。原核生物的基因重组原核生物的基因重组原核生物的基因重组形式很多，机制较原始。原核生物的基因重组形式很多，机制较原始。特点：特点： 片段性，仅一小段片段性，仅一小段DNA序列参与重组；序列参与重组； 单向性，即从供体菌向受体菌（或从供体基因组向受体基因组）作单向性，即从供体菌向受体菌（或从供体基因组向受体基因组）作单方向转移；单方向转移； 转移机制独特而多样，如接合、转化和转导等。转移机制独特而多样，如接合、转化和转导等。（一）接合（一）接合（conjugation，mating） 供体菌供体菌（“雄性雄性”）通过通过性毛性毛与与受体菌受体菌（“雌性雌性”）直接接触，把）直接接触，把F F质粒质粒或其携带的不同长度的或其携带的不同长度的核基因组片段核基因组片段传递给后者，使后者获得若干新遗传传递给后者，使后者获得若干新遗传性状的现象，称为性状的现象，称为接合接合。通过接合而获得新遗传性状的受体细胞，就是。通过接合而获得新遗传性状的受体细胞，就是接接合子合子（conjugant）。）。1946年，年，Joshua Lederberg 和和Edward L.Taturm细菌的多重营养缺陷型杂交实验细菌的多重营养缺陷型杂交实验通过细胞与细胞的直接接通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转触而产生的遗传信息的转移和重组过程移和重组过程中间平板上长出的原养型中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了菌落是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致！遗传交换和重组所致！AB-过滤器U U型管实验型管实验n存在范存在范围：n细菌：菌：G 较为多多见如如E. coli(大大肠杆菌杆菌)、Salmonella(沙沙门门氏菌氏菌)、Shigella(志志贺氏菌氏菌)、Serratia(粘粘质质沙雷菌沙雷菌)、Vibrio(弧菌属弧菌属) 、Azotobacter(固氮菌固氮菌) 、Klebsiella(克雷白氏杆菌属克雷白氏杆菌属)和和Pseudomonas(假假单单胞胞菌属菌属)等最等最为常常见n放放线菌：菌：Streptomyces(链霉菌属霉菌属) 、Nocardia(诺卡氏卡氏菌属菌属)n接合接合还可可发生在生在不同属不同属的菌种之的菌种之间，如，如E. coli与与Salmonella typhimurium之之间或或S. typhimurium与与Shigella dysenteriae之之间大肠杆菌的接合机制大肠杆菌的接合机制接合作用是由一种被称为接合作用是由一种被称为F因子的质粒介导因子的质粒介导F因子的分子量通常为因子的分子量通常为5107，上面有编码细菌产生性毛（，上面有编码细菌产生性毛（sex pili）及控制接合及控制接合过程进行的过程进行的20多个基因。多个基因。含有含有F因子的细胞：因子的细胞：“雄性雄性”菌株（菌株（F+），），其细胞表面有性毛其细胞表面有性毛不含不含F因子的细胞：因子的细胞：“雌性雌性”菌株（菌株（F-），），细胞表面没有性毛细胞表面没有性毛F因子为附加体质粒因子为附加体质粒可脱离染色体在细胞内独立存在，可插入（整合）到染色体上可脱离染色体在细胞内独立存在，可插入（整合）到染色体上F F因子的四种细胞形式因子的四种细胞形式a）F F- -菌株菌株， 不含不含F因子，没有性毛，但可以通过接合作用接收因子，没有性毛，但可以通过接合作用接收F因子而因子而变成雄性菌株（变成雄性菌株（F+）；）；b）F F+ +菌株菌株， F因子独立存在，细胞表面有性毛。因子独立存在，细胞表面有性毛。c）HfrHfr菌株菌株，F因子插入到染色体因子插入到染色体DNA上上，细胞表面有性毛。，细胞表面有性毛。d）FF菌株菌株，Hfr菌株内的菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，因子因不正常切割而脱离染色体时， 形成游形成游离的但携带一小段染色体基因的离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为因子，特称为F因子。因子。 细胞表面同样有性细胞表面同样有性毛。毛。接合的一般过程接合的一般过程n接合接合时F+细胞与胞与F 细胞相遇，性菌毛与胞相遇，性菌毛与F 细胞表面胞表面发生吸附生吸附而形成接合管；而形成接合管；nF+细胞内，胞内，F因子的一条因子的一条DNA单链在特定的位点上在特定的位点上发生断裂；生断裂；n断裂后的断裂后的单链逐步解开，同逐步解开，同时以另一条留存的以另一条留存的环状状单链做模板，做模板，通通过模板的模板的滚动，一方面把解开的，一方面把解开的单链以以5为先先导通通过性菌毛性菌毛推入推入F 细胞中，另一方面，在供体胞中，另一方面，在供体细胞内以胞内以滚动的的环状模板重状模板重新合成一条互新合成一条互补的的环状状单链，以取代，以取代传递到到F 细胞中的那条胞中的那条单链。这种种DNA复制机制称复制机制称为滚环模型（模型（rolling circle model）；）；n在在F 细胞中，以外来的供体胞中，以外来的供体DNA线状状单链为模板合成一条互模板合成一条互补单链，并随之恢复成，并随之恢复成环状双状双链F因子。因子。n至此，原来的至此，原来的F 菌株菌株变成了成了F+ 菌株。原来的供体仍菌株。原来的供体仍为F+ 菌株。菌株。（二）转导（二）转导（transduction）通过通过病毒病毒（defective phage）的媒介，把供体细胞的小片段的媒介，把供体细胞的小片段DNA携带携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象，到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为称为转导转导。获得新遗传性状的受体细胞，就称。获得新遗传性状的受体细胞，就称转导子转导子（transductant）。）。由噬菌体介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式：由噬菌体介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式：一个细胞的一个细胞的DNADNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中 能将一个细菌宿主的部分染色体或质粒能将一个细菌宿主的部分染色体或质粒DNA带到另一个细菌带到另一个细菌的噬菌体称为的噬菌体称为转导噬菌体转导噬菌体。细菌转导的二种类型：细菌转导的二种类型：普遍性转导普遍性转导局限性转导局限性转导流产普遍转导流产普遍转导完全普遍转导完全普遍转导1.1.普遍转导普遍转导（generalized transduction） 通过极少数通过极少数完全缺陷噬菌体完全缺陷噬菌体对对供体菌供体菌任何小片段任何小片段DNA进进行行“误包误包”，而将其遗传性状传递给，而将其遗传性状传递给受体菌受体菌的现象，称为的现象，称为普遍转普遍转导导。一般用温和噬菌体作为普遍转导的媒介。一般用温和噬菌体作为普遍转导的媒介。（1 1）完全普遍转导完全普遍转导 简称简称普遍转导普遍转导或或完全转导完全转导（complete transduction）。经转导。经转导噬菌体的媒介而获得了供体菌噬菌体的媒介而获得了供体菌DNA片段的受体菌，外源片段的受体菌，外源DNA在其内进行在其内进行交换、整合和复制交换、整合和复制，使其成为一个遗传性状稳定的重组体，称作，使其成为一个遗传性状稳定的重组体，称作普遍转导普遍转导子子，这种现象就称普遍转导。，这种现象就称普遍转导。Salmonella typhimurium（鼠伤寒沙门氏菌）鼠伤寒沙门氏菌）的野生菌株的野生菌株Salmonella typhimurium（鼠伤寒沙门氏菌）鼠伤寒沙门氏菌）的营养缺陷型突变株的营养缺陷型突变株P22嗜菌体嗜菌体供体菌供体菌受体菌受体菌转导模型供体菌供体菌受体菌受体菌转导媒介转导媒介噬菌体噬菌体误包误包转导颗粒转导颗粒普遍转导子普遍转导子双双交交换换同源配对同源配对10-610-8过程：过程：（1）P22在供体菌内增殖时，宿主的核染色体组断裂，待噬菌体成熟与包装之际，在供体菌内增殖时，宿主的核染色体组断裂，待噬菌体成熟与包装之际，极少数（极少数（10 6 10 8）噬菌体的衣壳将与噬菌体头部核心大小相似的一段供体）噬菌体的衣壳将与噬菌体头部核心大小相似的一段供体DNA片段误包入其中，形成了一个完全不含噬菌体自身片段误包入其中，形成了一个完全不含噬菌体自身DNA的缺陷噬菌体。的缺陷噬菌体。（2）供体菌裂解时，如把少量裂解物与大量受体菌群体相混，这种完全缺陷噬菌）供体菌裂解时，如把少量裂解物与大量受体菌群体相混，这种完全缺陷噬菌体就会将这一外源体就会将这一外源DNA片段导入受体细胞内。片段导入受体细胞内。（3）在这种情况下，由于一个受体细胞只感染了一个完全缺陷噬菌体，故受体细）在这种情况下，由于一个受体细胞只感染了一个完全缺陷噬菌体，故受体细胞不会发生往常的溶原化，也不显示其免疫性，更不会裂解和产生正常的噬菌体；胞不会发生往常的溶原化，也不显示其免疫性，更不会裂解和产生正常的噬菌体；而由于导入的外源而由于导入的外源DNA片段可与受体细胞核染色体组上的同源区段配对，在通过双片段可与受体细胞核染色体组上的同源区段配对，在通过双交换而整合到受体菌染色体组中，所以使后者成为一个遗传性状稳定的转导子。交换而整合到受体菌染色体组中，所以使后者成为一个遗传性状稳定的转导子。S.typhimurium的的P22P22噬菌体噬菌体、E.coli的的P1P1噬菌体噬菌体、Bacillus subtilis的的PBS1PBS1和和SP10SP10等噬菌体等噬菌体都能进行都能进行完全普遍转导完全普遍转导。供体菌供体菌转导媒介转导媒介噬菌体噬菌体受体菌受体菌（2 2）流产普遍转导流产普遍转导 简称简称流产转导流产转导（abortive transduction）。经转导噬菌体的媒介。经转导噬菌体的媒介而获得了供体菌而获得了供体菌DNA片段的受体菌，外源片段的受体菌，外源DNA在其内既在其内既不进行交换、整不进行交换、整合和复制合和复制，也不迅速消失，而仅进行转录、转译和性状表达，这种现象，也不迅速消失，而仅进行转录、转译和性状表达，这种现象就称流产转导。就称流产转导。受体菌受体菌外源外源DNA细胞分裂细胞分裂外源基因经转录、转译而外源基因经转录、转译而形成的少量酶形成的少量酶获得外源获得外源DNADNA获得少量酶获得少量酶不不断断稀稀释释特点：在选择培养基平板上形成微小菌落特点：在选择培养基平板上形成微小菌落DNA不能复制，因此群体中仅一个细胞含有不能复制，因此群体中仅一个细胞含有DNA，而其它细胞只能得到其基因产物，形成微小菌落。而其它细胞只能得到其基因产物，形成微小菌落。普遍性转导的三种后果：普遍性转导的三种后果：进入受体的外源进入受体的外源DNA通过与细胞染通过与细胞染色体的重组交换而形成稳定的色体的重组交换而形成稳定的转转导子导子。流产转导流产转导（abortive transduction）转导转导DNA不能进行重组和复制，但其不能进行重组和复制，但其携带的基因可经过转录而得到表达。携带的基因可经过转录而得到表达。特点：在选择培养基平板上形成微小菌落特点：在选择培养基平板上形成微小菌落外源外源DNA被降解，转导失败。被降解，转导失败。DNA不能复制，因此群体中仅一个细胞含有不能复制，因此群体中仅一个细胞含有DNA，而其它细胞只能得到其基因产物，形成微小菌落。而其它细胞只能得到其基因产物，形成微小菌落。2.2.局限转导局限转导（specialized transduction， restricted transduction） 指通过指通过部分缺陷的温和噬菌体部分缺陷的温和噬菌体把把供体菌供体菌的少数的少数特定基特定基因因携带到携带到受体菌受体菌中，并与后者的基因组整合、重组，形成转导子的现中，并与后者的基因组整合、重组，形成转导子的现象。象。 最初于最初于1954年在年在E. coliK12中发现。中发现。特点：特点： 只只局限于传递供体菌核染色体上的局限于传递供体菌核染色体上的个别特定基因个别特定基因，一般为噬菌体一般为噬菌体整合位点两侧的基因；整合位点两侧的基因； 该特定基因由该特定基因由部分缺陷的温和噬菌体部分缺陷的温和噬菌体携带；携带； 缺陷噬菌体的形成方式是由于它在脱离宿主染色体过程中，发生低频率缺陷噬菌体的形成方式是由于它在脱离宿主染色体过程中，发生低频率（10-5）“误切误切”（不正常切离，（不正常切离，abnormal excesion）或由于双重或由于双重溶源菌的溶源菌的裂解裂解而形成；而形成； 局限转导噬菌体的产生要通过局限转导噬菌体的产生要通过UV等因素对溶源等因素对溶源菌的菌的诱导诱导并引起裂解后才产生。并引起裂解后才产生。局局限限转转导导低频转导低频转导高频转导高频转导根据转导子出现频率的高低分类根据转导子出现频率的高低分类温和噬菌体感染温和噬菌体感染整合到细菌染色体的特定位点上整合到细菌染色体的特定位点上宿主细胞发生溶源化宿主细胞发生溶源化溶源菌因诱导而发生裂解时，在前噬菌体溶源菌因诱导而发生裂解时，在前噬菌体二侧的少数宿主基因因偶尔发生的不正常二侧的少数宿主基因因偶尔发生的不正常切割而连在噬菌体切割而连在噬菌体DNA上上部分缺陷的温和噬菌体部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中缺陷噬菌体在宿主细胞内能够象正常的缺陷噬菌体在宿主细胞内能够象正常的DNA分子一样进行复制、包装，提供所分子一样进行复制、包装，提供所需要的裂解功能，形成需要的裂解功能，形成转导颗粒转导颗粒。但没有正常噬菌体的但没有正常噬菌体的溶源性和增殖能力溶源性和增殖能力，感染受体细胞后，通过，感染受体细胞后，通过DNA整合进宿主染色体而形成稳定的整合进宿主染色体而形成稳定的转导子转导子。E. coli的的嗜菌体嗜菌体和和8080嗜菌体嗜菌体具有局限转导的能力。具有局限转导的能力。比较项目比较项目普遍性转导普遍性转导局限性转导局限性转导转导的基因转导的基因供体染色体或染色体供体染色体或染色体外的任何基因外的任何基因供体染色体上与原噬菌体紧密供体染色体上与原噬菌体紧密连锁的少数几个个别基因连锁的少数几个个别基因噬菌体寄生噬菌体寄生的位置的位置不结合在寄主染色体不结合在寄主染色体特定位置上特定位置上结合在寄主染色体特定位置上结合在寄主染色体特定位置上获得转导噬获得转导噬菌体的方法菌体的方法通过敏感菌的裂解或通过敏感菌的裂解或容源菌的诱导容源菌的诱导紫外线诱导容源菌紫外线诱导容源菌转导子的区转导子的区别别一般稳定，非溶原性一般稳定，非溶原性（不表现出任何噬菌（不表现出任何噬菌体的性状，包括免疫体的性状，包括免疫性）性）一般不稳定，呈缺陷溶原性一般不稳定，呈缺陷溶原性（对同源噬菌体具有免疫性，（对同源噬菌体具有免疫性，但不表现出其它噬菌体的性状）但不表现出其它噬菌体的性状）普遍性转导和局限性转导的比较受体菌受体菌（recipient cell，receptor）直接吸收直接吸收供体菌供体菌（donor cell）的的DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象，称为转化或转片段而获得后者部分遗传性状的现象，称为转化或转化作用。化作用。通过转化方式而形成的杂种后代，称通过转化方式而形成的杂种后代，称转化子转化子（transformant）。（三）转化（三）转化（transformation） 1.1. 定义定义原核生物原核生物Streptococcus pneumoniae（肺炎链球菌）、肺炎链球菌）、Haemophilus（嗜血杆菌属）、嗜血杆菌属）、Bacillus（芽孢杆菌属）、芽孢杆菌属）、Neisseria（奈瑟氏球菌属）、奈瑟氏球菌属）、Rhizobium（根瘤菌属）、根瘤菌属）、Staphylococcus（葡萄球菌属）、葡萄球菌属）、Pseudomonas（假单胞菌属）、假单胞菌属）、Xanthomonas（黄单胞菌属）等。黄单胞菌属）等。2.2. 转化微生物的种类转化微生物的种类真核微生物真核微生物Saccharomy cescerevisiae（酿酒酵母）、酿酒酵母）、Neu-rosporacrassa（粗糙脉孢菌）、粗糙脉孢菌）、Aspergillusniger（黑曲霉）等。黑曲霉）等。 受体细胞要处于感受态受体细胞要处于感受态.感受态感受态：competence，受体细胞能从环境吸取外源，受体细胞能从环境吸取外源DNA片段并实现其片段并实现其转化的一种生理状态转化的一种生理状态供体供体DNA片段片段（转化因子）转化因子）大小适宜，分子量一般为大小适宜，分子量一般为1 107 D 左右左右 菌株间的亲缘关系密切菌株间的亲缘关系密切3 3、转化发生的条件、转化发生的条件感受态感受态（competence）感受态感受态是指受体细胞最易接受外源是指受体细胞最易接受外源DNA片段并能实现转化片段并能实现转化的一种生理状态。的一种生理状态。研究发现，能发生转化的受体细胞都处于感受态。研究发现，能发生转化的受体细胞都处于感受态。 感受态细胞感受态细胞（competent cell）具有摄取外源具有摄取外源DNA能能力的细胞。力的细胞。自然感受态自然感受态是细胞一定生长阶段的生理特性，受细菌自身的基因控制；是细胞一定生长阶段的生理特性，受细菌自身的基因控制；人工感受态人工感受态则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取DNA的能力，或人为地将的能力，或人为地将DNA导入细胞内。导入细胞内。（该过程与细菌自身的遗传控制无关！）（该过程与细菌自身的遗传控制无关！） 感受态感受态感受感受态受受遗传控制，但也存在个体差异。控制，但也存在个体差异。n感受感受态出出现的的时间不同；不同；n出出现时间：只在：只在细菌生菌生长的某一的某一时期出期出现；不同菌种的感；不同菌种的感受受态出出现在不同生在不同生长时期期nStreptococcus pneumoniae（肺炎（肺炎链球菌）的感受球菌）的感受态出出现在生在生长曲曲线中的指数期的中期，中的指数期的中期，nBacillus（芽胞杆菌属）的一些种（芽胞杆菌属）的一些种则往往出往往出现在指数期在指数期末及末及稳定期的初期。定期的初期。 感受态感受态n感受感受态细胞的比例：当胞的比例：当处于感受于感受态高峰高峰时，群体中呈感受，群体中呈感受态的的细胞因菌种而不同胞因菌种而不同.nBacillus subtilis不超不超过1015%nStreptococcus pneumonia和和Haemophilus influenzae（流感嗜血杆菌）达到（流感嗜血杆菌）达到100%n感受感受态由由细胞的胞的遗传性决定，但同性决定，但同时也受也受环境因子的影响：境因子的影响：cAMP、Ca2+等最明等最明显。如用。如用CaCl2 处理理E. coli可以可以诱发其其产生感受生感受态。n转化化DNA的最低的最低浓度：在群体中含有度：在群体中含有15%感受感受态细胞胞时，0.1 gDNA/ml细胞胞悬液即可有效液即可有效发生生转化化调节感受态的一类特异蛋白称调节感受态的一类特异蛋白称感受态因子感受态因子。膜相关膜相关DNADNA结合蛋白结合蛋白（membrane-associated DNA binding protein）细胞壁细胞壁自溶素自溶素（autolysin）几个核酸酶几个核酸酶转化因子转化因子（transforming principle） 转化因子转化因子的本质是离体的的本质是离体的DNA片段。一般只有片段。一般只有15kb左左右。右。在不同的微生物中，转化因子的形式不同。在不同的微生物中，转化因子的形式不同。良好的转化因子有良好的转化因子有dsDNA（最宜于细胞表面结合）、最宜于细胞表面结合）、ssDNA和和质粒质粒DNA，通常不能与核染色体组发生重组。通常不能与核染色体组发生重组。转化的频率通常为转化的频率通常为0.11.0，最高为，最高为20。能发生转化的最低。能发生转化的最低DNA浓度极低，为化学方法无法测出的浓度极低，为化学方法无法测出的1105 gmL（即即11011gmL ）。）。自然遗传转化自然遗传转化（natural genetic transformation）人工转化人工转化（artificial transformation） 4 4、转化的类型、转化的类型根据感受态建立的方式，可以分为：5.5. 转化过程转化过程（1）自然遗传转化（简称自然转化）自然遗传转化（简称自然转化） 1928年，年，Griffith发现肺炎链球菌（发现肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）的转的转化现象，化现象，转化过程研究得较深入的就是这种转化过程研究得较深入的就是这种G细菌。细菌。目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力进行自然转化，需要二方面必要的条件：进行自然转化，需要二方面必要的条件：建立了感受态的受体细胞建立了感受态的受体细胞外源游离外源游离DNA分子分子转化的过程 以以S. Pneumonia strr（肺炎链球菌抗链霉素菌株）为例，大致可分为六阶段：（肺炎链球菌抗链霉素菌株）为例，大致可分为六阶段：吸附：吸附：双链双链DNA片段与细胞表面的特定位点（主要在新形成细胞壁的赤道区）结合，片段与细胞表面的特定位点（主要在新形成细胞壁的赤道区）结合，此时，细胞膜上的胆碱可促进这一过程。在吸附过程的前阶段，如外界加入此时，细胞膜上的胆碱可促进这一过程。在吸附过程的前阶段，如外界加入DNA酶，酶，就会减少转化子的产生。稍后，就会减少转化子的产生。稍后，DNA酶即无影响，说明此时该转化因子已进入细胞；酶即无影响，说明此时该转化因子已进入细胞；切割：切割：在吸附位点上的在吸附位点上的DNA被核酸内切酶分解，形成平均分子量为被核酸内切酶分解，形成平均分子量为45106的的DNA片段；片段；入胞入胞：DNA双链中的一条单链被膜上的另一种核酸酶切除，另一条单链逐步进入细双链中的一条单链被膜上的另一种核酸酶切除，另一条单链逐步进入细胞，这是一个耗能的过程。分子量小于胞，这是一个耗能的过程。分子量小于5105的的DNA片段不能进入细胞。这时如用片段不能进入细胞。这时如用低浓度溶菌酶处理，因它提高了细胞壁的通透性，故可提高转化频率；低浓度溶菌酶处理，因它提高了细胞壁的通透性，故可提高转化频率；转化的过程重组：重组：来自供体菌的单链来自供体菌的单链DNA片段在细胞内与受体细胞核染色体组上的同源区配对，片段在细胞内与受体细胞核染色体组上的同源区配对，接着受体染色体组上的相应单链片段被切除，并被外来的单链接着受体染色体组上的相应单链片段被切除，并被外来的单链DNA交换、整合和取交换、整合和取代，于是形成了一个杂合代，于是形成了一个杂合DNA区段（区段（heterozygous region）。在这一过程中，有核）。在这一过程中，有核酸酶、酸酶、DNA聚合酶和聚合酶和DNA连接酶的参与；连接酶的参与；复制：复制：受体菌的染色体组进行复制，杂合区段分离成两个，其中之一获得了供体菌受体菌的染色体组进行复制，杂合区段分离成两个，其中之一获得了供体菌的转化基因，另一个未获供体基因；的转化基因，另一个未获供体基因；转化子形成：转化子形成：当细胞发生分裂后，一个子细胞含供体基因，这就是转化子；另一个当细胞发生分裂后，一个子细胞含供体基因，这就是转化子；另一个细胞与原始受体菌一样。细胞与原始受体菌一样。枯草芽孢杆菌的自然转化过程（革兰氏阳性菌的转化模型）枯草芽孢杆菌的自然转化过程（革兰氏阳性菌的转化模型）strR，存在抗链霉素的基因标记存在抗链霉素的基因标记strS，有链霉素敏感型基因标记有链霉素敏感型基因标记自然转化过程的特点：自然转化过程的特点：a）对核酸酶敏感；对核酸酶敏感；c）转化是否成功及转化效率的高低主要取决于转化（转化是否成功及转化效率的高低主要取决于转化（DNA）供体菌和供体菌和受体菌之间的亲源关系；受体菌之间的亲源关系；d）通常情况下质粒的自然转化效率要低得多；通常情况下质粒的自然转化效率要低得多；b）不需要活的不需要活的DNA给体细胞；给体细胞；提高质粒的自然转化效率的二种方法：提高质粒的自然转化效率的二种方法：1）使质粒形成多聚体，这样进入细胞后重新组合成有）使质粒形成多聚体，这样进入细胞后重新组合成有 活性的质粒的几率大大提高；活性的质粒的几率大大提高；2）在质粒上插入受体菌染色体的部分片段，或将质粒转化进含有与该质）在质粒上插入受体菌染色体的部分片段，或将质粒转化进含有与该质粒具有同源区段的质粒的受体菌粒具有同源区段的质粒的受体菌重组获救重组获救。（2）人工转化）人工转化用用CaCl2处理细胞，电穿孔等是常用的人工转化手段。处理细胞，电穿孔等是常用的人工转化手段。在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段，是基因工在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段，是基因工程的奠基石和基础技术。程的奠基石和基础技术。不是由细菌自身的基因所控制；不是由细菌自身的基因所控制；用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一种可以摄取用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一种可以摄取外源外源DNA的的“人工感受态人工感受态”。质粒的转化效率高；质粒的转化效率高；可转化的形状可转化的形状荚膜多糖的合成荚膜多糖的合成专一性酶的合成专一性酶的合成专一性蛋白质的合成专一性蛋白质的合成抗药性抗药性（四（四）原生质体融合原生质体融合（protoplast fusion）通过人为的方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体进行通过人为的方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定的重组子的过程，称为融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定的重组子的过程，称为原生质体融合原生质体融合。由此法获得的重组子，成为由此法获得的重组子，成为融合子融合子（fusant）。）。n适用范适用范围：各种生物各种生物细胞都能胞都能进行原生行原生质体融合，包括各种体融合，包括各种原核生物、真核微生物以及高等原核生物、真核微生物以及高等动植物和人体的不同植物和人体的不同细胞。胞。n意意义：70年代后年代后发展的一种育种新技展的一种育种新技术，继转化、化、转导和接和接合之后一种更有效的合之后一种更有效的转移移遗传物物质的手段。原生的手段。原生质体融合不体融合不仅能在不同菌株或种能在不同菌株或种间进行，行，还能做到属能做到属间、科、科间甚至更甚至更远缘的微生物或高等生物的微生物或高等生物细胞胞间的融合。的融合。n发展点：展点：有关原生有关原生质体融合的体融合的遗传机制，尚未研究清楚，目机制，尚未研究清楚，目前前还在探索中。在探索中。选择两个有特殊价值的并带有选择性遗传标记的细胞作为亲本选择两个有特殊价值的并带有选择性遗传标记的细胞作为亲本脱壁酶脱壁酶细菌或放线菌可用细菌或放线菌可用溶菌酶溶菌酶或或青霉素青霉素处理，处理，真菌可用真菌可用蜗牛酶蜗牛酶或其他相应的或其他相应的脱壁酶脱壁酶等等离心聚集离心聚集在高渗溶液中稀释在高渗溶液中稀释加入促融合剂或电脉冲加入促融合剂或电脉冲各种选择性培养基各种选择性培养基原生质体融合的主要步骤是：原生质体融合的主要步骤是：选择亲株选择亲株 制备原生质体制备原生质体原生质体融合原生质体融合 原生原生质体质体 再生再生 筛选优良性状的融合重组子筛选优良性状的融合重组子原生质体融合的重组频率已大于原生质体融合的重组频率已大于10-1（而诱变育种一般仅为（而诱变育种一般仅为10-6）；）；同种的不同同种的不同菌株间菌株间或或种间种间进行融合，进行融合，属间、科间属间、科间甚至更远缘的微生物或高等生物细胞间的融合，以期甚至更远缘的微生物或高等生物细胞间的融合，以期达到生产性状更为优良的新物种达到生产性状更为优良的新物种。l原生质体融合的优点：原生质体融合的优点： 可以提高重组率可以提高重组率 双亲可以少带标记或不带标记双亲可以少带标记或不带标记 可进行多亲本融合可进行多亲本融合 有利于不同种间、属间微生物的杂交有利于不同种间、属间微生物的杂交 通过原生质体融合提高产量通过原生质体融合提高产量 二、真核微生物的基因重组二、真核微生物的基因重组有性杂交有性杂交准性杂交准性杂交原生质体融合原生质体融合遗传转化遗传转化（一）有性杂交（一）有性杂交（sexual hybridization）杂交杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重组方式。是在细胞水平上发生的一种遗传重组方式。有性杂交有性杂交，一般指不同遗传型的两性细胞间发生的接合和随之进行的染色体重组，一般指不同遗传型的两性细胞间发生的接合和随之进行的染色体重组，并产生新遗传型后代的一种育种技术。并产生新遗传型后代的一种育种技术。（二）准性杂交（二）准性杂交（parasexual hybridization）准性生殖是一种类似于有性生殖，但比它更为准性生殖是一种类似于有性生殖，但比它更为原始原始的一种两的一种两性生殖方式，这是一种在同种而不同菌株的体细胞间发生融合，它性生殖方式，这是一种在同种而不同菌株的体细胞间发生融合，它可不借减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子。可不借减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子。