TOPO 克隆技术与基因定点突变技术克隆技术与基因定点突变技术北京全式金生物技术有限公司www.transgen.com.cn1背景资料基因克隆是分子生物学必不可少的工具，传统的T4 DNA Ligase方法实验周期长。TOPO克隆5分钟快速克隆，是克隆技术的革命。这个技术上的飞跃为实现“加速科研”的理念提供了先决条件。基因定点突变技术改造基因的便利方法。基因功能研究已经成为生命科学研究的新热点，因此需要强有力的工具保证基因结构和功能关系研究的进行。2TOPO克隆技术TOPO克隆原理TOPO克隆策略TOPO克隆成功的关键TOPO克隆常见问题及解决方法3TOPO克隆原理TOPO即Topoisomerase 拓扑异构酶特点：由316个氨基酸组成识别5-CCCTT-3同时具有限制性内切酶和连接酶的功能不需要能量4TOPO克隆原理5TOPO克隆过程6TOPO克隆过程TOPO克隆迅速、便捷载载 体体片片 段段产产 物物5 min7TOPO克隆克隆策略有无杂带？有无引物二聚体？PCR产物无杂带，有引物二聚体均有或有杂带均无Gel Extraction KitPCR Purification Kit基因克隆、转化8TOPO克隆和传统T4克隆比较Topo克隆T4 DNA Ligase克隆PCR产物无需纯化可直接用于克隆（若无杂带和引物二聚体）需要纯化，否则抑制连接反应时间5分钟过夜（12小时）操作载体+片段（污染几率小）载体+片段+T4 DNA Ligase Buffer+T4 DNA Ligase（污染几率大）克隆效率85%60%特点省时（至少节约1天）快速、高效费时9TransGen TOPO VectorpEASY-T1 Cloning VetorpEASY-T1 Simple Cloning VetorpEASY-T3 Cloning VetorpEASY-Blunt Cloning VetorpEASY-Blunt Simple Cloning VetorpEASY-E1 Expression VetorpEASY-E2 Expression Vetor10克隆载体图谱TA Cloning11克隆载体图谱Blunt Cloning12表达载体TA Cloning一步法载体构建一步法载体构建藉由藉由TOPO技术实现技术实现!13TOPO克隆成功的关键引物设计PCR条件克隆反应设置（DNA加入量、反应的温度和时间）克隆感受态细胞的选择选用质量好的胶回收或PCR纯化试剂盒14引物设计： 引物不能磷酸化； 引物5端第一个碱基会影响下游的连接效率；PCR注意事项： 后延伸设置为721020分钟； 目的： 保证扩增片段完整，可以有效降低扩增背景； 使用Taq系列DNA聚合酶扩增时，该步骤相当于加A反应。 15目的片段加入量为保证良好的连接效率，推荐如下 700bp以及更小的片段：保证20ng 700bp以上的片段：保证30100ng 2Kbp左右的片段：保证40ng 3Kbp左右的片段：保证60ng 片段加入量max：4l，浓度很低时也有一定的连接效率， 体积大于5 l会破坏反应体系平衡； 片段加入量min：0.5l，浓度很高时需要稀释， 可以补充无菌水方便操作。反应温度： TOPO酶的工作温度为203716反应时间：PCRPCR产物物 / PCR/ PCR纯化化产物物25 5min25 5min胶回收胶回收产物物/ /加加A A产物物25 10min251015min25 15min【大片段、特殊结构】25 20min【大片段、特殊结构】17克隆感受态细胞的选择：Top10适用于毒基因的克隆DH5普遍使用JM109同源重组率低，提取质粒质量最好XL1-Blue适合非甲基化DNA的转化（必要时可以代替DMT）Mach1-T1具有T1、T5噬菌体抗性，在液体培养基中生长速度快OmniMAX2-T1具有T1、T5噬菌体抗性，可用于文库构建TL-Blue适用于大质粒DNA和重组产物的转化降低片段大小的偏爱性，可用于文库构建18选择质量好的胶回收或PCR纯化试剂盒： 试剂品质很关键 质量不好的试剂盒很可能会抑制下游连接19TOPO克隆常见问题及解决方法克隆数少（确认感受态细胞效率正常时）克隆阳性率低PCR鉴定重组子失败菌落多为淡蓝色或FishEye（白边蓝芯）20反应时间产物不新鲜克隆数少或阳性率低：胶回收片段DNA浓度低毒基因基因特殊结构21上述五种情况，均需要适当延长连接反应时间！以保证连接效率和克隆数。（可参考上文的载体连接反应时间）另外每种情况也有一些特别的地方可以改进，进一步提高克隆效果。22PCR产物不新鲜：Why 3端热力学不稳定，3“A”容易脱落 直接导致TA克隆效率低How PCR产物置于4保存12天内使用 不要冷冻PCR产物 PCR结束后立即使用效果最好23克隆胶回收片段：Why 紫外照射和EB对dsDNA造成损伤； (受到损伤的DNA不是连接的最佳底物) 3-“A”容易在电泳过程中被核酸外切酶降解，导致TA连接效率低； 试剂残留的抑制。How 操作中通过细节注意避免24目的片段浓度很低：Why 无法保证有效碰撞How 浓缩DNA25毒基因：Why其本底表达产物对宿主生长有明显抑制How 选用Top1026基因特殊结构：Why 具有高AT、高GC、反向重复序列的基因，不容易连接How 调整、摸索连接体系和条件 尝试不同的载体，不同的骨架对片段偏好性不同27PCR鉴定重组子失败：现象：用通用引物鉴定时，扩增产物既无目的带又无载体自连带How 预变性95 10min （彻底裂解菌体、释放DNA） 最好能用通用引物鉴定所谓连接失败实为误判！所谓连接失败实为误判！28菌落多为淡蓝色或FishEye：Why 插入片段没有影响LacZ基因读码框 插入片段小（小于400bp）How 不要丢弃平板！ 进行进一步鉴定所谓连接失败实为误判！所谓连接失败实为误判！29基因定点突变技术利用PCR实现点突变的几种传统方法GeneTailor，QuickChange， Easy /Fast Mutagenesis System 三种市售点突变试剂盒的比较30传统方法：仅利用PCR反向PCR定点突变重叠延伸PCR定点突变大引物PCR定点突变31反向PCR：特点：必须以质粒为模板；引物方向相反；引物需要磷酸化。32重叠延伸PCR：特点：两轮PCR33大引物PCR：特点：两轮PCR34GeneTailor，QuickChange，Easy/Fast Mutagenesis System也是基于PCR原理实现点突变，但它们与传统方法的区别主要在于可以对突变克隆进行初步的筛选筛选原理：降解甲基化质粒模板筛选依据： 来自大肠杆菌的质粒99%发生甲基化； PCR是去甲基化过程，PCR产物（发生突变的产物）是去甲基化的产物。35筛选方法：体内降解：原始质粒模板可以被能降解甲基化质粒的大肠杆菌（DMT）降解，而去甲基化的扩增产物（发生突变的产物）不会被降解。体外降解：DpnI识别序列5-GmATC-3（在DNA序列中，一般每256bp中出现一次）。甲基化模板可被DpnI识别、切割，而去甲基化的扩增产物（发生突变的产物）不会被降解。36Invitrogen：GeneTailor Mutagenesis System优点引物部分重叠，指数扩增扩增产物可见，易于操作筛选方法：DMT体内降解缺点：突变点在一条引物上无DpnI限制性内切酶降解模板37Stratagene：QuickChange Mutagenesis System优点：筛选方法：DpnI限制性内切酶缺点：引物完全重叠，线性扩增， 扩增产物不可见，可操作性差扩增产物为线状无DMT体内消化降解模板38TransGen:Easy/Fast Mutagenesis System共有部分：PCR组分、DpnI酶、DMT细胞Easy Mutagenesis System： 使用EasyPfu酶Fast Mutagenesis System： 使用FastPfu酶 扩增速度比Taq更快、保真性比Pfu更高，扩增10Kb左右的质粒只需2个小时！ （请参考金品是怎样炼成的）39TransGen：引物部分重叠，指数扩增，扩增产物可见，易于操作；扩增产物为环状；两条引物上均有突变点，突变效率高；DpnI体外降解筛选 + DMT体内降解筛选=双重双重筛选！ 大大提高阳性率。40TransGen：Easy/Fast Mutagenesis System 引物设计示意图正向引物上的突变点 反向引物上的突变点FWD 55 REV33重叠区重叠区延伸区延伸区41引物设计引物设计扩增特点扩增特点模板降解方法模板降解方法InvitrogenGeneTailer部分重叠部分重叠突变位点位于突变位点位于一条引物上一条引物上指数扩增，产物可见指数扩增，产物可见产物为环状产物为环状 DMTDMT细胞体内降解细胞体内降解StratageneQuickChange完全重叠完全重叠突变位点位于突变位点位于两条引物上两条引物上线性扩增，产物不可线性扩增，产物不可见见产物为线状产物为线状DpnDpnI I酶体外降解酶体外降解TransGenEasy/Fast Mutagenesis部分重叠部分重叠突变位点位于突变位点位于两条引物上两条引物上指数扩增，产物可见指数扩增，产物可见产物为环状产物为环状DMTDMT细胞体内降解细胞体内降解DpnDpnI I酶体外降解酶体外降解4243