端粒、端粒、端粒酶的研究进展端粒酶的研究进展1 早在早在30年代，两名遗传学家年代，两名遗传学家Muller和和Mcclintock分别在不同的实验室用不同的生物做实验发现染色分别在不同的实验室用不同的生物做实验发现染色体末端结构对保持染色体的稳定十分重要，体末端结构对保持染色体的稳定十分重要，Muller将这一结构命名为将这一结构命名为端粒（端粒（telomere）。直到直到1985年年Greider等从四膜虫中真正证实了端粒的结构为极简等从四膜虫中真正证实了端粒的结构为极简单的单的6个核苷酸个核苷酸TTAGGG序列的多次重复后发现了序列的多次重复后发现了端粒酶端粒酶(telomeraseTRAP-eze)。 2 在端粒被发现以前，人们就推测生殖细胞之在端粒被发现以前，人们就推测生殖细胞之所以能世代相传，其中可能存在一种维持端粒长所以能世代相传，其中可能存在一种维持端粒长度的特殊机制，体细胞可能正是由于缺乏这种机度的特殊机制，体细胞可能正是由于缺乏这种机制，它的染色体末端才面临着致死性缺失制，它的染色体末端才面临着致死性缺失（deletion）的危险。因此在正常人体细胞间永生的危险。因此在正常人体细胞间永生化细胞（化细胞（immortalizedcells）及肿瘤细胞的转化及肿瘤细胞的转化过程中可能也存在着与生殖细胞类似的机制，但过程中可能也存在着与生殖细胞类似的机制，但这一直末予证实。十多年来对端粒和端粒酶的结这一直末予证实。十多年来对端粒和端粒酶的结构与功能有了较深入的认识。构与功能有了较深入的认识。3一、人类染色体端粒及端粒酶：一、人类染色体端粒及端粒酶： 1972年年JamesWatson提出了提出了“复制末端问题复制末端问题”，复制，复制DNA的的DNA多聚酶并不能将线性染色体末端多聚酶并不能将线性染色体末端的的DNA完全复制。也就是说在线性完全复制。也就是说在线性DNA复制时，复制时，DNA多聚酶留下染色体末端一段多聚酶留下染色体末端一段DNA（一段端粒）一段端粒）不复制。端粒不复制。端粒DNA复制的特点是在每次复制的特点是在每次DNA复制中，复制中，每条染色体的每条染色体的3端均有一段端均有一段DNA无法得到复制，随无法得到复制，随着细胞每次分裂，着细胞每次分裂，染色体染色体3一末端将持续丧失一末端将持续丧失50-200bp的的DNA，因而细胞分裂具有一定的限度，即因而细胞分裂具有一定的限度，即分裂寿命。分裂寿命。所以所以端粒的长度可作为细胞的端粒的长度可作为细胞的“分裂时分裂时钟钟”，反映细胞分裂能力，反映细胞分裂能力。真核细胞染色体末端会。真核细胞染色体末端会随着细胞分裂而缩短，这个缩短的端粒再传给子细随着细胞分裂而缩短，这个缩短的端粒再传给子细胞后，随细胞的再次分裂进一步缩短胞后，随细胞的再次分裂进一步缩短。4 随随着着每每次次细细胞胞分分裂裂，染染色色体体末末端端逐逐渐渐缩缩短短，细细胞胞进进入入不不可可逆逆的的抑抑制制状状态态，直直至至细细胞胞衰衰老老，此此过过程程即即称称为为复复制制性性衰衰老老。人人类类体体细细胞胞遵遵循循这这个个规规则则从从细细胞胞出出生生到到衰衰老老，单单细细胞胞生生物物遵遵循循这这个个规规则则分分裂裂后后定定有有其其它它机机制制保保持持单单细细胞胞生生物物传传代代存存活活，生生殖殖细细胞胞亦亦如如此此，这这些些细细胞胞怎怎样样保保持持细细胞胞具具有有继继续续分分裂裂或或长长期期分分裂裂的的能能力力呢呢？科科学学家家们们发发现现端端粒粒确确实实随随着着每每次次分分裂裂而而缩缩短短，但但也也会会被被新新合合成成的的端端粒粒片片断断再再延延长长。科科学学家家们们怀怀疑疑，可可能能尚尚有有末末被被发发现现的的酶酶，该该酶酶具具有有标标准准的的DNA多多聚聚酶酶所所不不具具备备的的功功能能，能能使使已已缩缩短短的的端端粒粒延延长长，使使科科学学家家们们兴兴奋奋的的是是到到1985年年首首先先在在四四膜膜虫中证实了这种能使虫中证实了这种能使端粒延长的酶端粒延长的酶端粒酶端粒酶的存在。的存在。5 端粒（端粒（telomere）是真核细胞线性染色体未端的一种特殊结构，由简单重复富含G碱基的DNA序列及端粒结合蛋白共同构成。人类染色体端粒序列已分离克隆，主要由5-15个kb的5TTAGGG3上千次的重复序列构成，它就像二顶帽子盖在染色体两端，能保持遗传信息的完整性，保护染色体免受重组和未端降解酶的作用，并提供一种可消耗的非编码序列以暂时缓解或取消复制问题所带来的染色体DNA的进行性缩短。大多数体细胞的端粒随周期性复制而逐渐缩短，最终达到一个临界点，细胞增殖停止、死亡，这可能是生命有限的重要原因之一。 6体细胞的端粒有限长度（体细胞的端粒有限长度（telomererestrictionfragmentsTRFS）大多数明显短于生殖细胞，青年大多数明显短于生殖细胞，青年人的人的TRFs又显著长于年长者，提示又显著长于年长者，提示TRFs随着细胞随着细胞分裂或衰老，在不断变短，主要是由于分裂或衰老，在不断变短，主要是由于DNA聚合酶聚合酶不能完成复制成线性不能完成复制成线性DNA末端所致。末端所致。缺少端粒的染色体不能稳定存在，这是因为端粒DNA与结构蛋白形成的复合物如同染色体的一顶“帽子”，它既可保护染色体不被降解，又避免了端粒对端融合（end-end fusion）以及染色体的丧失，同时端粒能帮助细胞识别完整染色体和受损染色体。在生理情况下，端粒作为细胞“分裂时钟分裂时钟”能缩短，最终导致细胞脱离细胞周期。7 端粒酶（端粒酶（telomerase）催化端粒合成，是一种逆转录酶，能以自身的RNA为模板，反向合成TTAGGG，不断地加在DNA未端，肿瘤细胞能够不断地分裂增生，“端粒酶RNA”结构的存在是先决条件。 现认为，人的端粒酶RNA可分为两个区与引物作用：一个是模板区，含有与引物互补的11个核苷酸模板区序模板区序列为列为11nt(5CUAACCCUAAC-3）；另一个锚定区，与引物的5端相配，为DNA链向3 端正核酶外延伸提供路径，而端粒酶中的蛋白质则起催化反应合成的作用。 8 人类端粒酶人类端粒酶RNA（humantelomeneseRNAhTR）是细胞端粒合成不可缺少的模板，若模板区突变，缺失或反义RNA可导致端粒的相应改变或丢失。经转染的细胞端粒序列发生改变，细胞即出现凋亡或分化。hTR非模板区序列或空间构象的变化也可使端粒酶失去活性。在胃癌及神经肿瘤的研究中已发现，hTR表达与细胞增殖密切相关。端粒酶是在染色体末端不断合成端粒序列的酶，它可以维持端粒的长度，维持细胞增殖潜能。 9 端粒酶由RNA和蛋白质蛋白质两部分组成。以自身RNA为模板合成端粒酶重复序列，具有逆转录酶活性，它的活性不依赖于DNA聚合酶，对RNA酶、蛋白酶和高温均敏感。端粒酶活性表达能稳定端粒的长度，抑制细胞的衰老，在生殖细胞和干细胞中可检测到高水平的端粒酶活性。 10二、死亡期细胞假说与细胞永生化二、死亡期细胞假说与细胞永生化 细胞获得永生必须克服两个危机期，M1（mortality stage 1）和M2（mortality stage 2）在M1期细胞对生长因子等失去反应，产生DNA合成蛋白抑制因子，细胞周期检查点（cell cycle checkpoints）发送细胞周期停止信号，DNA合成即告停止。细胞端粒开始缩短，并启动终止细胞分裂信号，正常人的双倍体细胞不能进一步分裂，开始衰老、死亡。一些癌基因SV40T抗原、抑癌基因P53，和Rb突变均能使M1期的机制被抑制,使细胞逃逸M1期，继续生长获得额外的增殖能力，此时端粒酶仍为阴性，端粒继续缩短，经过20-30次分裂后，最终到达M2期。此时因端粒太短而致染色体极不稳定，于是大多数细胞退化死亡，极少数细胞由于激活了端粒酶，端粒功能得以恢复，染色体形态稳定，可以超越M2期使细胞永生化。 11 端粒酶被抑制 正常人体细胞 端粒丢失 M1期阻滞 SV40T抗原 细胞分裂停止 Rb、P53与病毒蛋白结合、突变 M1M2期间隔 永生化 双着丝粒形成 M2期退化 染色体失稳 端粒酶被激活 细胞凋亡 附图：端粒酶在人体细胞永生性转化中附图：端粒酶在人体细胞永生性转化中12三、端粒酶与肿瘤发生三、端粒酶与肿瘤发生 端端粒粒酶酶是是最最近近肿肿瘤瘤研研究究的的热热门门话话题题。端端粒粒酶酶具具有有使使肿肿瘤瘤细细胞胞系系继继续续复复制制生生存存的的特特点点，成成为为近近期期生生命命科科学学界界关关心心与与研研究究的的一一个个热热点点。端端粒粒缺缺陷陷的的染染色色体体不不稳稳定定性性通通过过促促进进半半合合子子化化（hemizygosing）、转转位位（tranlocation）、扩扩增增及及重重组组装装而而加加速速肿肿瘤瘤进进程程。端端粒粒磨磨耗耗（attrition）的的最最终终结结果果是是端端粒粒酶酶的的活活化化，以以弥弥补补端端粒粒的的丢丢失失而而使使细细胞胞无无限限增增殖殖，成成为为永永生生细细胞胞。因因此此端端粒粒酶酶活活化化是是肿肿瘤瘤进进入入晚晚期期，而而且且是细胞永生的关键一步。是细胞永生的关键一步。13 为什么在绝大多数永生细胞系可以表达端粒为什么在绝大多数永生细胞系可以表达端粒酶活性，而在非永生细胞则不能？酶活性，而在非永生细胞则不能？为什么人类大多数体细胞中不能检测到端粒为什么人类大多数体细胞中不能检测到端粒酶，而在一些肿瘤细胞中则能检测到端粒酶？酶，而在一些肿瘤细胞中则能检测到端粒酶？14 近年来围绕这一问题展开了大量的研究，积累了丰富的资料，至今仍是一个值得探讨的领域。自从1994年Kim等创立TRAP法检测端粒酶活性以来，越来越多的文献证明端粒酶活性在大多数人类原发性肿瘤标本及肿瘤衍生细胞系中可被检测到，如前列腺癌、乳癌、口腔癌、肺癌、肝癌、胃肠基质瘤、膀胱上皮细胞癌及AML急性髓性白血病。15 Shay等报道了几年不同学者对肿瘤端粒酶探讨的检测结果，总结了正常组织（196例），原位癌（410例），恶性肿瘤（2031例）和癌旁组织（690例）的端粒酶的阳性率，它们分别是0.5%、30%、85%和11%。在前列腺癌、乳腺、胰腺、肺、肝的早期癌中端粒酶的阳性率为85.0%95.0%，而对应的癌旁或良性病变组织中，端粒酶基本上不能检出或活性极微弱。因此，尽管有研究认为，端粒长度维持还可以借助于非端粒酶依赖模式，即ALT（altematireLengtheningoftelomere）机制，机制，但其存在上并不能否认永生化细胞中端粒酶的重要作用。16 美国学者在美国学者在400多例来源于多例来源于12种不同组织的原发种不同组织的原发肿瘤病例中，肿瘤组织的端粒酶阳性率高达肿瘤病例中，肿瘤组织的端粒酶阳性率高达84.8，而肿瘤周围组织或良性病变中阳性率仅为而肿瘤周围组织或良性病变中阳性率仅为4.4，说，说明明端粒酶活性与肿瘤生物学行为密切相关。端粒酶活性与肿瘤生物学行为密切相关。端粒酶端粒酶阳性的肿瘤比阴性的肿瘤有更大的恶性倾向阳性的肿瘤比阴性的肿瘤有更大的恶性倾向。通过。通过PCR技术形成的端粒重复扩增技术检测前列腺癌，技术形成的端粒重复扩增技术检测前列腺癌，31例中有例中有27例（例（87%）有高表达的酶活性，国内刘）有高表达的酶活性，国内刘洪坤总结有洪坤总结有84%前列腺癌中检测到端粒酶活性。端前列腺癌中检测到端粒酶活性。端粒酶可能是保持前列腺癌细胞持续生长必须的酶，粒酶可能是保持前列腺癌细胞持续生长必须的酶，在细胞恶变过程中端粒酶激活是个非常重要的步骤在细胞恶变过程中端粒酶激活是个非常重要的步骤。 17 有学者用鼠皮肤做模型，进行化学诱导致癌，分析处于乳腺癌不同阶段的端粒酶活性，结果发现早期乳腺癌细胞是二倍体细胞，分化较好，而晚期乳腺癌则是非整倍体细胞且分化较差，同时端粒酶活性进行性增加，并伴随着基因水平的不稳定性。在随后的研究中也得出了相同的结论，表明人乳腺癌的进程与端表明人乳腺癌的进程与端粒酶的活化密切相关，提示端粒酶可以作为诊断乳腺粒酶的活化密切相关，提示端粒酶可以作为诊断乳腺癌的指标。癌的指标。18 美国学者在慢性髓性白血病（CML）和急性髓性白血病（AML）的端粒动力学研究中，用southern印迹法测量端粒长度，用stretch-PCR法测出端粒酶活性，在CML白细胞中，端粒酶活性非常低与正常组织相似。但若CML急性发作时，白细胞中端粒酶活性就表现为显著升高。表明CML由慢性到急性发作时，高度激活了端粒酶。通过对CML和AML病情进展研究，发现所有病例中肿瘤细胞的端粒与相应正常细胞相比都是缩肿瘤细胞的端粒与相应正常细胞相比都是缩短的，这可能是由于肿瘤细胞分裂次数远远大于正常短的，这可能是由于肿瘤细胞分裂次数远远大于正常细胞之故。细胞之故。 19 端粒缩短和端粒酶激活的情况，人们称之为端端粒缩短和端粒酶激活的情况，人们称之为端粒危机粒危机，这是肿瘤细胞克隆繁衍的强大驱动力，促进肿瘤的发展。有些实体肿瘤细胞中端粒并末缩短而是延长出现了矛盾的现象。 端粒危机的的假说有两种解释：端粒危机的的假说有两种解释：1、由于大量正常细胞混迹于实体肿瘤样品中，因而用印迹转移分析法来检验端粒长度是不可信的。2、白血病与实体肿瘤细胞克隆繁衍机制不同。 20 许多血液学的恶性肿瘤都不会在局部形成肿瘤，细胞的增殖和循环都是单细胞的，因此每一个白血病细胞都将竞争更有效的增殖，端粒酶在单个白血病细胞中的表达是强烈的，瘤细胞分裂快速，端粒缩短，使突变细胞在短期内形成群落。与此相反实体肿瘤位于一点而不移动，因此子代对于不同突变的竞争被其紧邻所限制。实体肿瘤中大多数成功的克隆将比白血病细胞有更稳定的遗传特性。因为位于特殊环境中的特殊表型必须保持相当长的时间才能克隆形成群落，所以实实体体肿肿瘤瘤只只有有具具备备较较长长的的端端粒粒，才才能能有有较较稳稳定定的的遗遗传传特特性性，具具备备“最最好好”的的表表型型从从而而被被选选择择，进进而而生生长繁殖长繁殖。21附表附表人体组织中端粒酶活性人体组织中端粒酶活性肿瘤部位/类型 与肿瘤邻近正常组织/良性病变 肿瘤组织（%）肺3/68（4.4%）109/136（80.1%）乳腺2/28（7.1%）19/24（79.6%）前列腺1/18（5.6%）23/27（85.1%）结肠0/45（0）22/23（95.6%）肝1/1（100%）卵巢0/8（0）7/7（100%）肾0/55（0）40/55（72.7%）神经母细胞瘤 0/17（0）94/100（94%）血液（淋巴瘤，CLL ALL） 21/23（91.3%）脑6/8（75%）其它（头顶部，Wilms瘤） 8/93（8.6%） 24/26 (92.3) 合计 14/332 （4.2%） 365/430 (84.8)22 端粒长度是维持细胞永生所必须，从正常慢性肝炎肝硬化肝癌，端粒的长度进行性缩短，Tahara 检测33例原发性肝癌，其中28例（84.4%）有端粒酶活性，而在肝炎和肝硬化中均有低活性的酶存在，提示端粒酶活化可能在端粒酶活化可能在原发性肝细胞癌癌变过程中起重要作用。原发性肝细胞癌癌变过程中起重要作用。 23 更令人感兴趣的是乳腺细针穿刺标本，尿标本，膀胱和肠腔冲洗液脱落细胞的端粒酶活性检测中恶性肿瘤也有较高的阳性表达，这可能有助于肿瘤的早期诊断。Hiyama等 对胃癌患者进行端粒酶研究发现，端粒酶阳性患者其病灶较阴性者大，淋巴结端粒酶阳性患者其病灶较阴性者大，淋巴结转移率也高，预后差转移率也高，预后差 。24 然而，端粒酶与恶性肿瘤之间是否平行还有着很大的分歧。Hiyama等研究发现端粒酶活性的高低与神经母细胞瘤预后相关，高者预后差，低者预后好，在肺癌中，端粒酶活性高低与恶性度有相关性，胃癌、乳癌亦有类似的结果报告，但胃癌的端粒酶活性与肿瘤病理分级、DNA倍体、分期和预后间未发现有相关性。胡震研究认为端粒酶活性与肾细胞癌的病理分级、临床分期有正相关系，而贾瑞鹏等报道认为端粒酶活性与临床分期、病理分级无明显相关性，由此看来，各种恶性肿瘤的端粒酶表达阳性率不同，与肿瘤的恶性度相关性也不同。 25 有研究者在转基因小鼠的模型中发现，端粒酶活性仅在较晚期肿瘤中表达，而鼠端粒酶RNA（MTR）水平在癌前期即上调，且hTR水平与端粒酶活性并不平行36，Aviciion等对人肿瘤细胞株和恶性肿瘤标本的研究中也观察到类似结果，即hTR含量高的部分细胞株不表达端粒酶活性，而后随端粒酶增高，hTR水并不相应增加，这些结果提示端粒酶是在肿瘤进展的晚期被激端粒酶是在肿瘤进展的晚期被激活，而端粒酶活，而端粒酶RNA活性的上调是一早期事件活性的上调是一早期事件。26 基于这现象，在肿瘤治疗方面，是否可以设计一些药物来抑制端粒酶hTR表达的上调，减少端粒酶的活化有可能达到防治肿瘤和预防复发的目的，也有人利用反义核酸封闭hTR模板区，锤头状切割hTR特异序列或使hTR模板区定点突变、或改变hTR的空间构象等，消除hTR作为模板的功能，限制其合成端粒酶的作用。27四四.端粒酶与肿瘤细胞凋亡端粒酶与肿瘤细胞凋亡 众所周知，细胞凋亡对肿瘤有负调控作用，在恶性肿瘤的发生及演变过程中，一系列调控细胞生长与死亡的机制都发生了紊乱，包括：细胞周期的调控、信号传导途径、细胞凋亡、癌基因与抑制因的表达等，启动凋亡的某些基因位于端粒酶结构附近，完整的端粒结构可以抑制这些基因的表达伴随着细胞的分裂，正常体细胞染色体未端的端粒进行性变短，最后凋亡基因被启动，细胞进入死亡阶段。 28 Fu等发现，端粒酶具有抑制细胞凋亡的功能，且在端粒酶活性抑制的情况下，Bcl-2和Caspases抑制因子具有保护细胞免受凋亡的作用。因此，具有端粒酶活性和稳定的端粒长度的细胞，可以阻止细胞凋亡的发生。故表达端粒酶活性的恶性肿瘤细胞具有抗凋亡的能力表达端粒酶活性的恶性肿瘤细胞具有抗凋亡的能力，在肿瘤细胞内，端粒酶的激活就是细胞凋亡机制受抑的原因之一。 29五五.端粒酶与细胞周期端粒酶与细胞周期 尽管目前有关端粒酶与细胞周期细的关系尚不清楚，但体外培养细胞同步化研究发现，细胞周期的不同阶段，端粒酶的活性也不同，端粒酶活性在G1/S期进行性增加并于S期达到最大，在G2/M期活性几乎测不到，提示端粒酶维持端粒稳定的作用，可能S期处于活化状态，在非复制期处于静止状态。对细胞周期有抑制作用的药物也能影响到端粒酶的活性。 30 Aldous等用抗雌激素药物tamoxifen处理MCF-7gc癌细胞时，发现伴随着MCF-7细胞周期受抑于G0/G1期，端粒酶活性也随之下凋，但temoxifen并无直接抑制端粒酶活性的作用，Akjycma等发现用IFN-2处理Daudi淋巴瘤细胞，可使细胞周期停滞于G1期，端粒酶活性也明显下降，Sharma等用DMSO诱导人BurKitt淋巴瘤细胞Raji，可使之进入可逆的G0/G1期停滞状态，且不伴有可检测的分化表型改变；在此过程中，端粒酶活性呈动态改变，说明端粒酶活性的调节是细胞周期依赖性的端粒酶活性的调节是细胞周期依赖性的。 31 有研究表明，转染反义端粒RNA在封闭细胞的酶端粒活性表达的同时，伴发P21与P16表达水平的升高。P16和P21均在细胞周期的调控中起重要作用，均属于细胞周期蛋白激酶抑制蛋白，对G1/S期转换起负调节作用，它们通过影响CDK的活性阻止细胞进入S期，P21在转录水平还受P53的调控，即参与细胞调亡的调控。以上提示，由于在S期细胞端粒酶的活性受到抑制，并继发引起细胞周期蛋白激酶抑制因子P16和P21表达水平的显著增高，从而使细胞在从而使细胞在G1/S期转换受阻而影响细胞从期转换受阻而影响细胞从G1期过渡到期过渡到S期，并有可能延长细胞周期期，并有可能延长细胞周期。 32六、端粒酶与肿瘤抑制基因六、端粒酶与肿瘤抑制基因 抑癌基因Rb，P53 ，P16可以抑制细胞周期蛋白激酶，阻滞细胞分裂 ，但这些基因单独失活并不能诱发细胞永生。一些DNA肿瘤病毒可以使P53 ，Rb基因失活，增强细胞增殖能力。在一种与突变P53基因遗传有关的家族性癌症综合征Li-Fraumeni综合征病人中，对其成纤维细胞自发性永生过程进行观察，发现单纯P53突变或缺失可使细胞暂时脱离衰老，但不能避免退化。 33 在永生化细胞IV-CF中既有P53失活，又有P16表达缺失，还有端粒延长，但缺乏端粒酶活性，提示在体内细胞永生中还存在一种延长端粒的机制在体内细胞永生中还存在一种延长端粒的机制。 有些病毒蛋白具有多效性（pleiotropic effects），它不仅能与Rb，P53等抑癌基因结合，而且还可能与其它未辩明的因子结合。 说明端粒酶仅是引起细端粒酶仅是引起细胞永生的一种机制，除此以外，还有使细胞永生的胞永生的一种机制，除此以外，还有使细胞永生的其它机制，还有保持端粒长度的其它机制其它机制，还有保持端粒长度的其它机制，有待于进一步的研究。34七、端粒酶与衰老七、端粒酶与衰老 衰老即为老化，有生理性和病理性，生理性衰老(aging)是生物体自成熟期开始，随年龄增长发生的，并受遗传因素的影响，表现为全身复杂的形态结构和生理功能不可逆的退行性变化，而疾病或异常因素可引起病理性衰老（senility），是衰老现象的提早出现。 Faragher指出衰老细胞逐渐积累会导致人体衰老的进程（但不排除其它因素），正如美国科学家戴维、施莱辛格在2002年国际人类基因组大会所说的，人的人的干细胞有着旺盛的活力，但是细胞有新陈代谢，随着干细胞有着旺盛的活力，但是细胞有新陈代谢，随着年龄的增长，很多功能细胞因为老化或磨损而丧失了年龄的增长，很多功能细胞因为老化或磨损而丧失了原有的功能，然而他们却无法被排出体外，这些原有的功能，然而他们却无法被排出体外，这些“失失灵灵”的细胞越积越多，以致最终防碍了其它细胞的的细胞越积越多，以致最终防碍了其它细胞的“正常工作正常工作”，这很可能是人类衰老的真正因素。，这很可能是人类衰老的真正因素。35 对于人体衰老的延迟，一直都是人类不断追求的，端粒与端粒酶的发现为人类抗衰老带来了曙光。在体外培养中，衰老细胞部分随着增殖会逐渐增多。既然端粒酶活性表达能稳定端粒的长度，那么端粒在细胞复制中就不会丧失，细胞衰老的进程就可能被阻止，从而延长寿命这是人们研究端粒酶与抗衰老关系的热点。 中国科学家董坦君等研究发现P16基因并非通过激活端粒酶，而是通过调节Rb蛋白的活性来影响端粒的长度，抑制P16基因的表达，端粒长度缩短减缓，细胞寿命延长，衰老程度减轻。 Fuxe等报道P15的过度表达引起的复制性衰老方向与P16有相似的能力，同样伴有完整的Rb蛋白途径。 36 端粒酶延长端粒长度以减缓细胞衰老最早的证据来自Bodrar等的研究，1998年在Science上刊文报道：将人的端粒酶基因导入端粒阴性的正常人体细胞中，激活其表达并培养细胞，然后与未导入该基因的细胞比较，发现前者端粒显著延长，细胞分裂旺盛，细胞寿命比后者大大延长，更值得关注的是细胞并无肿瘤样改变。另外，Targ等发现一些正常啮齿动物的先驱细胞有一个无限制的增殖能力，但其培养需在避免分化和阻止细胞循环反应活性的前提下，Kudo等报道端粒酶活性和细胞凋亡可作为宫内发育延迟的胎盘衰老的指标。37 Maffson等认为在神经细胞分化和存活中，端粒酶与TERT功能的测定能较好理解神经细胞的功能，并可以促进神经细胞在各种各样神经元退化性病变条件下的恢复。阿尔茨海默病（阿尔茨海默病（Alzheimersdisease,AD）是一种常见的神经系统退化性老年病，其患者脑血管壁中可分离出致AD神经元退行性病变的淀粉样蛋白，zhu等利用antisense技术和端粒酶抑制剂引发胎鼠海马区神经细胞中TERT的功能抑制，发现显著增加了由淀粉样蛋白肽引起的细胞凋亡，而在脑细胞瘤中TERT的过量表达会降低这种细胞凋亡，其原因是TERT降低的神经细胞由于暴露于淀粉样蛋白中而增强了其氧化性，并使线粒体功能发生障碍，TERT在神经退行性病变中展现出神经的保护功能，提示在神经细胞中提高端粒酶活性可以抵止年龄相关的神经退行性病变，如AD和脑老化等。 38 激活端粒酶可以阻止衰老的过程，延长寿命，可是一旦激活端粒酶，这些细胞将有可能成为永生化细胞，衍化成癌细胞，为避免衰老而导致癌症，这显然不是人们的初衷。但Shay等认为导入端粒酶的细胞不会成为癌细胞，这是因为细胞本身并未累积成为癌细胞所需的改变。不过研究的重点还是应放在端粒酶的调控机制和细胞繁殖能力上，避免细胞无限分裂增殖而引发的肿瘤。 39八、端粒酶的检测方法八、端粒酶的检测方法1、TRAP： Kim等在1994年建立了能稳定，成批，快速分析各组织端粒酶活性的Trap方法。在小块组织甚至穿刺组织上提取少量组织进行端粒酶活性测定，Kim等利用PCR为基础的TRAP（telomeric repeat amplification protocol）方法，包括通过改良的去污溶解手段从少量细胞中获取富含端粒酶的提取物，然后利用端粒酶催化的引物延伸反应产物作为聚合酶链反应（PCR）的模板，允许产物呈指数扩增，建立了一种高效、特异的、敏感的端端重复扩增法（TRAP），其敏感性较传统扩增法提高了一万倍。 40 Kim指出端粒酶在肿瘤诊断中敏感性达85%，特异性达91%，标本中少至10个癌细胞即可测得端粒酶阳性。腹水、内镜下、细胞刷、细针穿刺、ERCP均可测定之，较病理检测阳性率高。此外还可应用多聚酶链反应-酶联免疫吸附法（PCR-ELISA）方法及分子生物学原位杂交技术检测端粒酶。 最近，Soriac等对转移性乳腺癌的病人通过外周血单核细胞俘获的上皮细胞检测出端粒酶阳性，特异性和敏感性均高，且为非侵入性的方法，这为端粒酶的检测提出了一新的途径。 41TRAP检测方法检测方法：制备S-100提取液，取出-80冻存的待检细胞，加20ul细胞裂解液0.5%CHAPS,10mmol/L Tris-HCL (PH 7.5),1mmol/l MgCl2,1mmol/l EGTA,5mmol/l -巯基乙醇，0.1mmol/l苯甲基磺酰氟，10%甘油酊，加样器反复吹打3次混匀，冰溶30min ，12000g 4离心 20min，收取上清，用Folicn-酚法进行蛋白定量。-80保存或检测。 42 端粒酶介导的端粒重复序列延伸： 取1ul S-100提取液（或取6ug蛋白质）在50ulTRAP反应液20mmol/l Tris-Hcl(PH8.3), 1.5mmol/l MgCl2, 68mmol/l KCl, 0.05%Tween-20, 0.1mmol/l EGTA, 50mmol/l dNTP,含0.1ug Ts引物；0.5umol/l T4g32蛋白，2u Taq DNA多聚酶，室温30min，上述反应均需无RNA酶操作。 43 PCR扩增端粒重复序列： 室温延伸后加引物0.1ug,94 2min 变性 94 30S ， 50 30S ，72 30S 40个循环。 10%聚丙烯凝胶电泳，17SV 45min ,280V 105min后银染色。 44 银染色： 聚丙烯凝胶电泳后，10%冰醋酸固定 20min,双蒸馏水洗 2min 3次。染色液（AgNO3lg/l,37% HCOH 1.5ml/l）中浸泡30min,双蒸水洗15S，在显色液（Na2CO3 30g/l,37%HCOH 0.5 ml/l Na2S2O3 5H2O 2mg/l ）中浸泡2-5min，加10%冰醋酸终止 10min，观察结果。 452 、 Yashima等提出用存档的石蜡病理标本以原位杂交的方法测定人类端粒酶RNA（human telonerase RNA, hTR）使得回顾性研究端粒酶活性与预后的关系成为可能，但是Avilion等报告的一组资料发现hTR在端粒酶阳性的所有病例中都表达，而在一些端粒酶阴性的病例中也有表达，hTR与端粒酶活性并不完全吻合，所以可能认为hTR可能不是预测端粒酶活性好的指标。 46九、端粒酶与肿瘤治疗九、端粒酶与肿瘤治疗由于端粒酶活性见于绝大多数恶性肿瘤，而人正由于端粒酶活性见于绝大多数恶性肿瘤，而人正常体细胞（生殖细胞、造血干细胞等除外）中未见该常体细胞（生殖细胞、造血干细胞等除外）中未见该酶活性，使得端粒、端粒酶已成为当今最引人注目的酶活性，使得端粒、端粒酶已成为当今最引人注目的抗瘤治疗新靶点。抗瘤治疗新靶点。 应用端粒酶的拮抗剂，治疗具有端粒酶活性的肿瘤细胞，限制其细胞寿命，最终导致细胞的特异性凋亡，这已成为癌症治疗学家关注的焦点。抑制端粒酶活性是否会导致肿瘤细胞死亡，而达到治疗肿瘤的目的呢？ 47 目前有2个思路： Greider和Blackburn提出的利用反义寡核苷酸取代四膜虫端粒酶模板区（hTR），从而阻断端粒酶活性。根据端粒酶含有的RNA是延长端粒酶模板的特点以阻断RNA模板，作为抑制端粒活性的治疗靶点。 使端粒酶DNA发生突变，突变型的端粒酶与野生型的端粒酶竞争端粒酶蛋白，导致合成错误的端粒序列使端粒丧失功能，并能导致细胞死亡。48 主要有以下几方面的对策主要有以下几方面的对策 1、阻阻断断端端粒粒酶酶RNA的的模模板板作作用用对对端端粒粒酶酶活活性性的抑制的抑制： 反义核苷酸、反义肽苷酸及硫代反义核苷酸对端粒酶活性的抑制，这是一些极有发展前途的癌症治疗新药。 核酶对端粒酶活性的抑制，核酶是具有特殊核酸内切酶活性的小分子RNA。Kanazawa等设计了一种锤型的核酶（Telo-R2）具有特异性的切割hTR模板区的功能。核酶有望成为广谱，低毒，高效的抗癌新药。49 2、核苷类似物对端粒酶活性的抑制、核苷类似物对端粒酶活性的抑制 底物抑制作用，即核苷类似物与端粒酶活性位点结合，形成失活的端粒酶-核苷复合物，从而抑制酶活性。 核苷类似物掺入端粒DNA中，形成不稳定的DNA-端粒酶RNA复合物，或因构象改变而导致合成中的端粒DNA从端粒酶中解离。 7-脱氮-dNTP阻碍鸟嘌呤四聚体等二级结构形成，导致端粒合成受阻。50 3、细胞分化诱导剂对端粒酶活性的抑制，正常人类干细胞经过分化，端粒酶活性受到抑制，是否永生的肿瘤细胞也可通过诱导其分化而抑制其端粒酶活性呢？具体机制有待进一步研究。 部分肿瘤细胞有较长的端粒（10kb）,随细胞有丝分裂，端粒缩短是个缓慢的过程，这种情况下端粒酶抑制剂是否有效尚待进一步证实。 51 端粒作为肿瘤的治疗新靶点，目前已逐渐被重视起来，但是，研究过程中也出现一些尚未解决的问题。在一些肿瘤细胞株中没有酶活性的表达，提示可能有非端粒酶介导的端粒长度控制途径，在临床监测中可能出现假阴性。另外，不同的瘤组织对不同的检测手段敏感性不同，只有我们对不同肿瘤的特性有了更充分的认识，才可找到更为专一敏感、可靠的检测方法，一旦上述的矛盾问题得以解决，肿瘤的临床监测与治疗会取得突破性进展，不仅如此，目前尚有研究证明端粒酶与其它一些疾病包括艾滋病都有一定相关性，可以预见，随着研究的深入，端粒酶将为多种疾病的诊断与治疗提供快捷、特异、副作用小的检测新途径。 52十、研究存在的问题十、研究存在的问题 端粒酶结构与功能的辩明，对于深入理解细胞衰老，永生及癌变机制具有非常重要的指导作用。但是目前仍存在不少问题，有待于解决。 端粒酶中RNA与蛋白质在催化或底物结合中 的确切机制； 模板RNA与DNA引物的作用途径； 人类端粒酶蛋白的分离、克隆；53 多数肿瘤端粒较短，端粒合成受抑后细胞可较快死亡。但少数端粒较长的肿瘤中，应用端粒酶抑制剂能否产生疗效，使人产生疑问？ 人体某些正常细胞如生殖细胞，造血细胞等也有端粒酶的活性，临床应用端粒酶抑制剂时，必须对生殖细胞、造血细胞等可能会出现的损害做出合适的评估与防范。54 随着端粒酶检测方法及基因随着端粒酶检测方法及基因克隆技术策略的改进，这些问题克隆技术策略的改进，这些问题将会被逐一解决。这将会为人们将会被逐一解决。这将会为人们在分子水平上判断和治疗癌症提在分子水平上判断和治疗癌症提供新的思路。供新的思路。5556