长江师范学院生命科学系长江师范学院生命科学系生化与分子生物学实验（二）实验三实验三 基因序列查找及基因序列查找及PCR引物设计引物设计 陈发波陈发波一、实验目的一、实验目的1 1、掌握、掌握PCRPCR扩增原理；扩增原理；2 2、学会在、学会在NCBINCBI网站上查找相关生物信息；网站上查找相关生物信息；3 3、学会利用、学会利用Primer5Primer5软件设计引物软件设计引物二、聚合酶链式反应（二、聚合酶链式反应（PCR）聚聚合合酶酶链链式式反反应应（Polymerase Chain Reaction，PCR）: 是是利利用用DNA片片段段旁旁侧侧两两个个短短的的单单链链引引物物，在在体体外外快快速速扩扩增增特特异异DNA片段的技术片段的技术。 PCR基本原理基本原理反应材料反应材料u模板模板DNAu引物对引物对按照与扩增区段两端序列彼此互补的原则设计；按照与扩增区段两端序列彼此互补的原则设计；uDNA聚合酶：耐高温聚合酶：耐高温Taq DNA polymerase、Pfu DNA polymeraseudNTPu缓冲液溶液缓冲液溶液Mg2+, Tris缓冲液溶液等缓冲液溶液等PCR反应步骤反应步骤u DNA解链（解链（变性变性）u 引物与模板引物与模板DNA相结合（相结合（退火退火）u DNA合成（合成（延伸延伸） 重复以上三个步骤重复以上三个步骤 经经多多次次循循环环之之后后，反反应应混混合合物物中中所所含含有有的的双双链链DNA分分子子数数，即即两两条条引引物物结结合合位位点点之之间间的的DNA区区段段的的拷贝数，理论上的最高值应是拷贝数，理论上的最高值应是2n 。反应仪器反应仪器PCR仪仪变性：变性：9494退火：退火：50-6050-60延伸：延伸：7272循环数：循环数：20-3020-30次次PCRPCR仪仪仪仪最终产物最终产物最终产物最终产物紫外光观察紫外光观察紫外光观察紫外光观察2-3 2-3 小时小时小时小时 凝胶成像系统 混合液混合液混合液混合液电泳电泳电泳电泳 我不大喜欢动手我不大喜欢动手, ,我宁肯不动手我宁肯不动手, ,我我不喜欢做费力的事。作为一个发明不喜欢做费力的事。作为一个发明家家, ,重要的一点是为解决某些问题而重要的一点是为解决某些问题而尽力设计一个简捷的动手方案尽力设计一个简捷的动手方案Kary B. Mullis (1944 -)http:/www.karymullis.com/三、基因序列查询三、基因序列查询vBCBI（美国国立生物信息中心）v 主页： http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/vMapview： http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/index.html四、引物设计四、引物设计引物设计有3条基本原则：1、引物与模板的序列要紧密互补2、引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构3、引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配) 引物设计考虑的主要因素引物设计考虑的主要因素1 1、引物长度：一般、引物长度：一般18-2418-24个碱基对个碱基对2 2、相似性较高序列相似性较高序列3 3、引物二聚体或发夹结构、引物二聚体或发夹结构4 4、引物序列的、引物序列的GCGC含量：一般为含量：一般为40-60%40-60%五、作业五、作业1 1、在、在NCBINCBI上查找一段基因序列，将碱基序列上查找一段基因序列，将碱基序列抄在实验报告上，标明基因名称、基因编号。抄在实验报告上，标明基因名称、基因编号。2 2、利用、利用Primer5 Primer5 软件设计一对与你查询基因软件设计一对与你查询基因序列相应的序列相应的PCRPCR扩增引物。扩增引物。